Kotransplantacja egzosomów pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych i autologicznych mitochondriów u pacjentów kandydujących do operacji CABG

Badanie to zostanie przeprowadzone jako retrospektywne badanie kohortowe w Teheran Heart Center. Pacjenci zostaną wybrani spośród kandydatów do CABG z bardzo niską frakcją wyrzutową określoną za pomocą echokardiografii plamkowej. Pacjenci z ciężkimi chorobami współistniejącymi lub uszkodzeniami mózgu zostaną wykluczeni z badania. Od pacjentów zostanie podjęta szczegółowa świadoma zgoda. Pacjenci, którzy odmówią wyrażenia zgody, otrzymają standardowe leczenie.

Kryteria

Kryteria przyjęcia:

• Pacjenci, którzy są kandydatami do CABG z powodu CAD±MR
• Historia MI z załamkiem Q, mniej niż jeden miesiąc
• Wiek: 35-80 lat
• LVEF
• Badanie żywotności potwierdzone przez echokardiogram stresowy z małą dawką dobutaminy i/lub badanie jądrowe redystrybucji talu (co najmniej cztery żywe segmenty).

Kryteria wyłączenia:

• Ciężkie choroby współistniejące (np. niewydolność nerek, niewydolność wątroby itp.)
• Brak możliwości wyrażenia świadomej zgody

• Uszkodzenie mózgu

  1. Grupy badawcze:

     Standardowym leczeniem wykonywanym u wszystkich pacjentów jest rewaskularyzacja poprzez operację wszczepienia pomostów aortalno-wieńcowych. Pacjenci zostaną podzieleni na cztery grupy w oparciu o otrzymane leczenie, oprócz standardowego leczenia.

     Transplantacja mitochondriów i egzosomów przez iniekcję dowieńcową i do mięśnia sercowego. Grupy badawcze:

     1. Dowieńcowa i domięśniowa iniekcja egzosomów (5 pacjentów)
     2. Dowieńcowa i domięśniowa iniekcja mitochondriów (5 pacjentów)
     3. Dowieńcowa i domięśniowa iniekcja egzosomów i mitochondriów (5 pacjentów)
     4. Placebo (5 pacjentów) W przypadku pacjentów z grup b i c mitochondria zostaną wyekstrahowane z próbki tkanki mięśniowej pobranej na początku operacji z mięśni piersiowych odsłoniętych po sternotomii. Mitochondria zostaną pobrane z próbki mięśniowej jednocześnie z operacją. Gdy rewaskularyzacja zostanie osiągnięta przez wszczepienie bajpasu, wyekstrahowane mitochondria zostaną wstrzyknięte do mięśnia sercowego. Strzykawka insulinowa o rozmiarze 31 G wykona zastrzyki w dziesięć różnych miejsc w niedokrwionym obszarze mięśnia sercowego. Oprócz bezpośredniego wstrzyknięcia do mięśnia sercowego, jedna trzecia wyekstrahowanych mitochondriów zostanie wstrzyknięta do zatoki wieńcowej.

     Pacjenci z grup aib otrzymają egzosom wyekstrahowany z komórek MSC opisany w kroku 2. Wyekstrahowany egzosom zostanie wstrzyknięty do zatoki wieńcowej po umieszczeniu krążenia pozaustrojowego.

  2. Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej pępowiny (UC-MSC) Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste pępowiny są izolowane enzymatycznie za pomocą kolagenazy zgodnie z poprzednim badaniem i hodowane w pożywce DMEM / F12 z 10% FBS zubożonym w egzosom (GMP stopnia) z penicyliną i antybiotykami streptomycyną i inkubowano w temperaturze 37°C i 5% CO2. Gdy konfluencja komórek osiągnie 80%, zbiera się kondycjonowaną pożywkę (do izolacji egzosomów komórki stosuje się w pasażu 3).

     Analizę fenotypową przeprowadza się w trzecim pasażu. Antygeny powierzchniowe analizuje się pod kątem CD90, CD105, CD73 i CD34 za pomocą cytometrii przepływowej.

  3. Ekstrakcja egzosomów z UC-MSC przez ultrawirowanie i charakteryzację.

     Gdy konfluencja komórek osiągnie 80%, kondycjonowaną pożywkę zbiera się w celu izolacji egzosomów za pomocą kilku ultrawirówek. W skrócie, po 48 godzinach kondycjonowaną pożywkę (CM) komórek wiruje się przy 400 g przez 10 minut w celu usunięcia komórek i przy 2500 g przez 30 minut w celu wyeliminowania ciałek apoptotycznych i szczątków. Następnie CM odwirowano dwukrotnie przy 100 000 g przez dwie godziny, po czym przeprowadzono proces zawieszania osadu egzosomu w PBS.

     Antygeny powierzchniowe analizuje się pod kątem CD9, CD63 i CD81, stosując technikę western blot. Ponadto zestaw Bradford Colorimetric Assay (BCA) służy do pomiaru całkowitego białka produkowanego przez egzosom przy długości fali 570 nm. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) określa rozkład wielkości egzosomów.

  4. Ekstrakcja mitochondriów z US-MSC i charakterystyka.

  5. Krótkoterminowa ocena bezpieczeństwa mitochondriów i egzosomów fazy I badania klinicznego:

     Pacjent będzie pod ścisłą obserwacją po operacji w oparciu o objawy kliniczne, oznaki, arytmię, ocenę echokardiograficzną i wyniki badań laboratoryjnych.

  6. Krótkookresowa ocena pacjenta pod kątem czynników krwi (cTnT, CK-MB) Kinaza kreatynowa (CK) i jej izoenzym CK-MB są kluczowymi narzędziami w diagnostyce ostrego zawału mięśnia sercowego (AMI). Zawartość CK-MB w stosunku do całkowitej CK w komórkach mięśnia sercowego jest zmienna; w prawidłowym mięśniu sercowym jest niski i kilkakrotnie zwiększony w niedotlenionym mięśniu sercowym i udarze serca.

  7. Skan SPECT, MRI serca i stresowa echokardiografia plamkowa z dobutaminą, przed i po 2 miesiącach.

     Ocena powrotu do zdrowia pacjenta zostanie przeprowadzona po miesiącu od operacji. Ocena ta opiera się na objawach przedmiotowych i podmiotowych pacjentów, ocenie klasy funkcji, stresie plamkowym i dobutaminowym Eco, skanowaniu jądrowym serca SPECT i rezonansie magnetycznym serca (CMR). Oceny zostaną przeprowadzone przed operacją i miesiąc po operacji. Przeprowadzone zostanie ścisłe porównanie wyników oceny w celu zgłoszenia możliwej poprawy stanu pacjenta.

     Oceniane zmienne do oceny uzupełniającej obejmują:

     • Zmienne frakcji wyrzutowej z Eco i CMR (LVEF, RVEF, Global EF)
     • 16 Analiza żywotności segmentów za pomocą skanu SPECT i CMR
     • Ocena klasyfikacji NYHA na podstawie badania fizykalnego pacjenta.
  8. Analiza danych zostanie przeprowadzona przez IBM SPSS Statistics wersja 25. Wartość p mniejsza niż 0,05 zostanie oceniona jako istotna.