Co-trasplante de exosomas derivados de células madre mesenquimales y mitocondrias autólogas para pacientes candidatos a cirugía CABG

Esta investigación se realizará como un estudio de cohorte retrospectivo en el Tehran Heart Center. Los pacientes se seleccionarán entre los candidatos a CABG con una fracción de eyección gravemente baja determinada por ecocardiografía moteada. Los pacientes con comorbilidades graves o daño cerebral serán excluidos del estudio. Se tomará el consentimiento informado detallado de los pacientes. Los pacientes que se nieguen a dar su consentimiento recibirán un tratamiento estándar.

Criterios

Criterios de inclusión:

• Pacientes candidatos a CABG por CAD±MR
• Antecedentes de IM con onda Q, menos de un mes
• Edad: 35-80
• FEVI
• Estudio de viabilidad evidenciado por ecocardiograma de estrés con dosis bajas de dobutamina y/o estudio nuclear de redistribución de talio (al menos cuatro segmentos viables).

Criterio de exclusión:

• Comorbilidades graves (por ejemplo, insuficiencia renal, insuficiencia hepática, etc.)
• Incapacidad para proporcionar consentimiento informado

• daño cerebral

  1. Grupos de estudio:

     El tratamiento estándar realizado para todos los pacientes es la revascularización mediante cirugía de injerto de derivación de la arteria coronaria. Los pacientes se dividirán en cuatro grupos según los tratamientos recibidos, además del tratamiento estándar.

     Trasplante de mitocondrias y exosomas mediante inyección intracoronaria e intramiocárdica. Grupos de estudio:

     1. Inyección intracoronaria e intramiocárdica de exosomas (5 pacientes)
     2. Inyección intracoronaria e intramiocárdica de mitocondrias (5 pacientes)
     3. Inyección intracoronaria e intramiocárdica de exosomas y mitocondrias (5 pacientes)
     4. Placebo (5 pacientes) Para los pacientes de los grupos b y c, las mitocondrias se extraerán de una muestra de tejido muscular extraída al comienzo de la cirugía de los músculos pectorales expuestos después de la esternotomía. Las mitocondrias se extraerán de la muestra de músculo simultáneamente con la cirugía. Cuando se logre la revascularización mediante los injertos de derivación, las mitocondrias extraídas se inyectarán en el músculo cardíaco. Una jeringa de insulina de calibre 31 realizará inyecciones en diez sitios diferentes en el área isquémica del músculo cardíaco. Además de la inyección directa en el músculo cardíaco, un tercio de las mitocondrias extraídas se inyectará en el seno coronario.

     Los pacientes de los grupos ayb recibirán el exosoma extraído de las células MSC descrito en el paso 2. El exosoma extraído se inyectará en el seno coronario después de la colocación del bypass cardiopulmonar.

  2. Aislamiento y caracterización de células madre mesenquimales del cordón umbilical humano (UC-MSC) Las células madre mesenquimales del cordón umbilical humano se aíslan enzimáticamente mediante colagenasa en términos de un estudio previo y se cultivan en medio DMEM/F12 con 10 % de FBS agotado en exosomas (GMP grado) con antibióticos penicilina y estreptomicina e incubados a 37°C y 5% CO2. Una vez que la confluencia celular alcanza el 80 %, se recoge el medio acondicionado (para el aislamiento de exosomas, las células se utilizan en el paso 3).

     El análisis fenotípico se realiza en el tercer pasaje. Los antígenos de superficie se analizan para CD90, CD105, CD73 y CD34 mediante citometría de flujo.

  3. Extracción de exosomas de UC-MSCs por ultracentrifugación y caracterización.

     Una vez que la confluencia celular alcanza el 80 %, varias ultracentrífugas recogen el medio acondicionado para el aislamiento del exosoma. En resumen, después de 48 h, el medio acondicionado (CM) de las células se centrifuga a 400 g durante 10 min para eliminar las células ya 2500 g durante 30 min para eliminar los cuerpos apoptóticos y los desechos. Posteriormente, CM se centrifugó dos veces a 100 000 g durante dos horas, seguido del proceso de suspensión del sedimento de exosomas en PBS.

     Los antígenos de superficie se analizan para CD9, CD63 y CD81 mediante transferencia Western. Además, el kit Bradford Colorimetric Assay (BCA) se utiliza para medir la proteína total de producción de exosomas a una longitud de onda de 570 nm. La dispersión de luz dinámica (DLS) determina la distribución de tamaño de los exosomas.

  4. Extracción de mitocondrias de US-MSC y caracterización.

  5. Evaluación a corto plazo de la seguridad del ensayo clínico de trasplante de mitocondrias y exosomas fase I:

     El paciente estará bajo estrecha vigilancia después de la cirugía en función de los síntomas clínicos, signos, arritmia, evaluaciones ecocardiográficas y resultados de laboratorio.

  6. Las evaluaciones a corto plazo del paciente en términos de factores sanguíneos (cTnT, CK-MB), la creatina quinasa (CK) y su isoenzima CK-MB son herramientas fundamentales para el diagnóstico de infarto agudo de miocardio (IAM). El contenido de CK-MB en relación con la CK total en las células miocárdicas es variable; en el miocardio normal, es bajo y aumenta varias veces en el miocardio hipóxico y en el infarto de miocardio.

  7. SPECT, Resonancia Magnética Cardíaca y Ecocardiografía Speckle de estrés con Dobutamina, antes y después de 2 meses.

     La evaluación de la recuperación del paciente se realizará un mes después de la cirugía. Esta evaluación se basa en los signos y síntomas de los pacientes, evaluaciones de clase de función, eco de estrés con dobutamina y moteado, exploración cardíaca nuclear SPECT e imágenes de resonancia magnética cardíaca (RMC). Las evaluaciones se realizarán antes de la cirugía y un mes después de la cirugía. Se realizará una estrecha comparación entre los resultados de la evaluación para informar posibles mejoras en la condición del paciente.

     Las variables evaluadas para la evaluación de seguimiento incluyen:

     • Variables de fracción de eyección de Eco y CMR (LVEF, RVEF, Global EF)
     • Análisis de viabilidad de 16 segmentos por SPECT scan y CMR
     • Evaluación de la clasificación de la NYHA basada en el examen físico del paciente.
  8. El análisis de datos se realizará mediante IBM SPSS Statistics versión 25. Un valor de p inferior a 0,05 se evaluará como significativo.