Medycyna precyzyjna w nocycepcji, słuchu i propriocepcji.

Medycynę precyzyjną definiuje się jako „nowe podejście do leczenia i zapobiegania chorobom, które uwzględnia indywidualną zmienność genów, środowiska i stylu życia każdej osoby” przez Inicjatywę Medycyny Precyzyjnej.

Ból jest definiowany przez Międzynarodowe Stowarzyszenie Badań nad Bólem (IASP) jako „nieprzyjemne doznanie zmysłowe i emocjonalne związane z rzeczywistym lub potencjalnym uszkodzeniem tkanki lub opisywane w kategoriach takiego uszkodzenia”. Tradycyjnie bolesność lub sng jest również uwzględniana jako jedno z odczuć bólowych. Niedawno zdefiniowaliśmy odczuwanie bólu jako odczucie kwasu i/lub bolesności w układzie somatosensorycznym i ujawniliśmy, że działanie przeciwbólowe w mięśniach odbywa się za pomocą substancji P i Tac1.

Zgodnie z wynikami klinicznymi, niektórzy pacjenci dobrze reagowali na środki fizyczne, a niektórzy preferowali zastrzyki. Warianty genetyczne powyższych genów mogą być czynnikami determinującymi zróżnicowane efekty terapeutyczne. Jednak przejście z jednej opcji leczenia na drugą zajęło pacjentowi około 4–8 tygodni. Jeśli na podstawie biomarkerów genetycznych uda nam się określić optymalną metodę leczenia, przebieg leczenia i całkowity zasięg znacznie się zmniejszą.

Stawiamy hipotezę, że warianty genetyczne proponowanych genów (TRPV1, ASIC1a, ASIC3, Tac1, COMT, TCL1A, POMC, RGS4, ASIC2, ASIC4, TRPA1, NK1R, G2A, GPR4, OGR1, TDAG8, TASK1, TASK2, TASK3, TREK1 , P2X2, P2X3, P2X5, TRPV4, KCNK1, NTSR1, NTSR2, CaV3.2, Nav1.1, Piezo1 i Piezo2, Runx3 lub Egr3, enzym podobny do konwertazy endoteliny 1 (ECEL1), geny łańcucha ciężkiego miozyny MYH3 i MYH8, Gen białka C wiążącego miozynę, MYBPC1 i TNNI2, TNNT3 i TPM2, które kodują białka regulujące mięśnie troponinę I, troponinę T i beta-tropomiozynę) mogą być prognostycznymi biomarkerami leczenia sng/bólu lub funkcji proprioceptywnej.

1. Cele szczegółowe

1. Opracowanie podejścia opartego na sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS) w celu znalezienia wariantów genetycznych, które mogą określić odpowiedź na metody leczenia sng/bólu i fenotyp skoliozy idiopatycznej.
2. Znalezienie możliwych markerów metabolomicznych i proteomicznych bólu/sng.
3. Określenie algorytmu medycyny precyzyjnej do kontroli bólu/bólu za pomocą markerów genetycznych.

2. W ostatnich latach nasz zespół odniósł pewne osiągnięcia uzasadniające poszukiwanie wariantów genetycznych pod kątem opracowania nowego algorytmu leczenia bólu.

1. Analgezja LLLT odbywa się za pośrednictwem TRPV1.
2. Analgezja za pomocą terapeutycznych ultradźwięków odbywa się za pośrednictwem ASIC3.
3. Wstrzyknięcie dekstrozy zmniejszyło przewlekły ból mięśni poprzez ASIC1a.
4. Biomarker bólu/bólu w fibromialgii.

3. Projekt badania

(1) Uczestnicy z kohorty A-zespołu bólu mięśniowo-powięziowego: zrekrutujemy 80 pacjentów z Narodowego Szpitala Uniwersyteckiego w Tajwanie i jego oddziału.

A. Kwalifikacja pacjenta:

1. Kryteria włączenia: (1) Wiek od 18 do 100 lat. (2) VAS>=30 lub VAS>=30 przy ciśnieniu 4 kg (3) Zdiagnozowano jako pacjentów z zespołem bólu mięśniowo-powięziowego i chętnych do leczenia (w tym LLLT, terapeutycznego USG i miejscowej terapii zastrzykami dekstrozy). Rozpoznanie MPS zostało potwierdzone przez głównego badacza na podstawie kryteriów naprężenia pasma, punktu spustowego i bólu promieniującego.
2. Kryteria wykluczenia: Wykluczono osoby z aktywną infekcją, nowotworem złośliwym i chorobami hematologicznymi. Wyklucza się także pacjentów, którzy otrzymali miejscowe zastrzyki w górny mięsień czworoboczny w ciągu 6 miesięcy.

B. Projekt badania:

1. Po uzyskaniu świadomej zgody zbierane są podstawowe dane demograficzne, m.in. wiek, płeć, zawód, poziom wykształcenia oraz historia chorób kwalifikujących się pacjentów.
2. Kwalifikujący się pacjenci najpierw otrzymali LLLT o długości fali 685 nm i mocy wyjściowej 30 mW (Laser BTL-5000, BTL, Stevenage, Wielka Brytania) przy gęstości energii 8 J/cm2 w punkcie spustowym górnego mięśnia czworobocznego. Zbiera się odpowiednio ból VAS i VAS-sng przed i po leczeniu w celu określenia fenotypu LLLT.
3. Następnie wygodnie dzieli się ich na dwie grupy (po 40 osób w każdej grupie): A. grupa terapeutyczna ultrasonograficzna; B. grupa proloterapii. Grupa A otrzymuje terapeutyczne ultradźwięki o częstotliwości 1 MHz przez 5 minut z częstotliwością 2-3 razy w tygodniu na bolesny mięsień czworoboczny górny. Grupa B otrzymuje proloterapię hipertoniczną na perimysium mięśnia czworobocznego górnego. Wstrzykiwaczem jest 5 ml 5% roztworu dekstrozy. Aby upewnić się, że igła nie znajduje się w naczyniu krwionośnym, przed wstrzyknięciem igłę zasysano. Ten sam lekarz (główny badacz) wstrzykuje wszystkim pacjentom, aby uniknąć różnic między lekarzami. Nie podano żadnego innego leku ani metody fizycznej, aby uniknąć zakłóceń skuteczności w obu grupach.
4. Rekrutowani pacjenci zostali poddani ocenie przed i po wstrzyknięciu oraz 2 tygodnie po wstrzyknięciu. Pierwszorzędowym wynikiem jest VAS-ból i VAS-sng (wizualna skala analogowa) z wynikiem 0-100, gdzie 100 to wartość reprezentująca najwyższy stopień bólu. Drugorzędnymi punktami końcowymi są próg bólu, napięcie mięśniowe i kwestionariusz SF-36-a składa się z 36 pozycji i 8 domen dotyczących postrzegania przez pacjenta QoL (jakości życia). Podczas pierwszej wizyty i wizyty po 2 tygodniach pobierano próbki krwi żylnej i moczu. Próbki krwi oznaczono zanonimizowanym numerem identyfikacyjnym, odwirowano i przechowywano w temperaturze -80°C w zamkniętej zamrażarce do czasu przyszłego przetwarzania. Kożuszek leukocytarny oddziela się po odwirowaniu i również przechowuje. Próbki moczu podzielono na porcje i przechowywano w temperaturze -80°C w zamkniętej zamrażarce do przyszłej analizy.
5. Terapia ratunkowa (leczenie krzyżowe): Jeśli uczestnik nie jest zadowolony z pierwszej rundy leczenia, a poprawa w skali VAS jest mniejsza niż 10, wówczas kwalifikuje się do terapii ratunkowej – leczenia z drugiej grupy. I wrócą do kliniki na kolejne 2 tygodnie. Zmienne wynikowe zostaną zebrane również podczas trzeciej wizyty.

(2) Uczestnicy z kohorty B-idiopatycznej skoliozy: Zrekrutujemy 80 pacjentów z Narodowego Szpitala Uniwersyteckiego w Tajwanie i jego oddziału oraz Szpitala Weteranów w Taichung.

A. Kwalifikacja pacjenta:

1. Kryteria włączenia: (1) Wiek od 10 do 65 lat. (2) Rozpoznana jako skolioza idiopatyczna. Rozpoznanie skoliozy potwierdzono badaniem rentgenowskim przednio-tylnym z kątem Cobbsa większym niż 10 stopni.
2. Kryteria wykluczenia: (1) Wykluczono osoby z aktywną infekcją, nowotworem złośliwym i chorobami hematologicznymi. (2) Osoby o specyficznej etiologii skoliozy, w tym skolioza wrodzona spowodowana wadami rozwojowymi lub wadliwą segmentacją kręgów oraz skolioza nerwowo-mięśniowa spowodowana brakiem równowagi mięśniowej, skoliozą syndromową lub skoliozą zwyrodnieniową.

B. Projekt badania:

1. Po uzyskaniu świadomej zgody zbierane są podstawowe dane demograficzne, m.in. wiek, płeć, zawód, poziom wykształcenia, poziom aktywności fizycznej oraz przebyta historia medyczna kwalifikujących się pacjentów.
2. Rekrutowani pacjenci otrzymują ocenę tylko raz. Zbierane parametry obejmują kąt Cobba, kąt rotacji kręgosłupa, VAS-ból i VAS-sng (wizualna skala analogowa) z punktacją 0-100, gdzie 100 to wartość reprezentująca najwyższy stopień bólu, próg bólu (Park, Kim i in. al. 2011), siłę i napięcie mięśnia przykręgosłupowego oraz kwestionariusz SF-36-a składa się z 36 pozycji i 8 domen dotyczących postrzegania przez pacjenta QoL (jakości życia) (Li, Wang i in. 2003). Pobrano także próbki krwi żylnej i moczu. Próbki krwi oznaczono zanonimizowanym numerem identyfikacyjnym, odwirowano i przechowywano w temperaturze -80°C w zamkniętej zamrażarce do czasu przyszłego przetwarzania. Kożuszek leukocytarny oddziela się po odwirowaniu i również przechowuje. Próbki moczu podzielono na porcje i przechowywano w temperaturze -80°C w zamkniętej zamrażarce do przyszłej analizy.

(3) Ekstrakcja DNA oraz sekwencjonowanie i genotypowanie w oparciu o NGS Genomowy DNA zostanie ekstrahowany z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej uczestników przy użyciu zestawu Gentra Puregene zgodnie z protokołem producenta (Qiagen, Hilden, Mettmann, Niemcy) i poddany działaniu agarozy żel i OD badania współczynnikowe w celu potwierdzenia jego czystości i stężenia. DNA będzie fragmentowane przy użyciu Covaris (Covaris, Woburn, MA, USA), mając na celu długość piku 800 bp. Biblioteki Illumina zostaną wygenerowane z gDNA przy użyciu zestawu do przygotowywania bibliotek TruSeq (Illumina, San Diego, Kalifornia, USA).

Sondy wychwytujące DNA zostaną zaprojektowane na zamówienie pod kątem TRPV1, ASIC1a, ASIC3, Tac1, COMT, TCL1A, POMC i RGS4 i będą syntetyzowane przy użyciu protokołu Roche KAPA HyperChoice (Roche, Madison, WI, USA). Uwzględnione zostaną wszystkie regiony kodujące i regiony niekodujące (promotory, introny, regiony nie podlegające translacji 5' i 3') tych 8 genów.

Wzbogacanie regionu docelowego NGS zostanie zastosowane w celu wzbogacenia/przechwycenia regionu docelowego (~148 Kb). Wzbogacone biblioteki zostaną następnie zsekwencjonowane przy użyciu Illumina MiSeq w celu wygenerowania odczytów na sparowanych końcach o długości 300 bp. Oczekiwana głębokość docelowych regionów będzie wynosić średnio 200x.

Analizy danych zostaną przeprowadzone w sposób opisany wcześniej. W skrócie, surowe dane sekwencjonowania zostaną dopasowane do referencyjnego ludzkiego genomu (22 lutego 2013 r.). 2009, GRCh37/hg19) przy użyciu BWA-MEM. Do wykonania niezbędnej konwersji, sortowania i indeksowania danych wykorzystamy Picard. Główny proces wywoływania wariantów, zarówno dla wariantów pojedynczych nukleotydów, jak i indeli, będzie obsługiwany za pomocą pakietu oprogramowania GATK. Zidentyfikowane zostaną również warianty konstrukcyjne. Zastosujemy ANNOVAR, aby odpowiednio opisać warianty genetyczne; obejmuje to co najmniej adnotację genu, adnotację zmiany aminokwasu, wyniki SIFT, wynik PolyPhen2, identyfikatory dbSNP, częstotliwości alleli 1000 Genome Project, częstotliwości alleli gnomAD i bazę danych ClinVar z wariantowym znaczeniem klinicznym. Następnie użyjemy IGV do wyświetlenia mapowania i adnotacji sekwencji w interfejsie graficznym.

Częstotliwości alleli interesujących nas wariantów zostaną porównane pomiędzy różnymi grupami uczestników. Będziemy szukać możliwych rzadkich wariantów o bardzo silnych efektach (model jednogenowy), a także stosunkowo powszechnych wariantów o umiarkowanych i silnych efektach (złożony model fenotypowy).