Medicina de precisão para nocicepção, percepção e propriocepção.

A medicina de precisão é definida como "uma abordagem emergente para tratamento e prevenção de doenças que leva em consideração a variabilidade individual em genes, ambiente e estilo de vida de cada pessoa" pela Precision Medicine Initiative.

A dor é definida como "uma experiência sensorial e emocional desagradável associada a dano tecidual real ou potencial ou descrita em termos de tal dano" pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP).Tradicionalmente, dor, ou sng, também é incluída como uma das sensações de dor. Recentemente, definimos a percepção como sensação de ácido e/ou dor no sistema somatossensorial, e revelamos que a analgesia no músculo se dá através da substância P e Tac1.

De acordo com o desfecho clínico, alguns pacientes responderam bem aos agentes físicos e alguns preferiram injeções. As variantes genéticas dos genes acima mencionados podem ser os fatores determinantes dos efeitos terapêuticos diferenciais. No entanto, demorava cerca de 4 a 8 semanas para um paciente mudar de uma opção de tratamento para outra. Se pudermos determinar a modalidade de tratamento ideal por meio de biomarcadores genéticos, o curso do tratamento e a extensão total diminuirão muito.

Nossa hipótese é que as variantes genéticas dos genes propostos (TRPV1, ASIC1a, ASIC3, Tac1, COMT, TCL1A, POMC, RGS4, ASIC2, ASIC4, TRPA1, NK1R, G2A, GPR4, OGR1, TDAG8, TASK1, TASK2, TASK3, TREK1 , P2X2, P2X3, P2X5, TRPV4, KCNK1, NTSR1, NTSR2, CaV3.2, Nav1.1, Piezo1 e Piezo2, Runx3 ou Egr3, enzima conversora de endotelina semelhante a 1 (ECEL1), genes de cadeia pesada de miosina MYH3 e MYH8, gene da proteína C de ligação à miosina, MYBPC1 e TNNI2, TNNT3 e TPM2 que codificam as proteínas reguladoras musculares troponina I, troponina T e beta-tropomiosina) podem ser os biomarcadores prognósticos de tratamentos de sng/dor ou função proprioceptiva.

1. Objetivos Específicos

1. Estabelecer uma abordagem baseada em sequenciamento de próxima geração (NGS) para encontrar variantes genéticas que possam determinar a resposta das modalidades de tratamento de sng/dor e o fenótipo da escoliose idiopática.
2. Encontrar possíveis marcadores metabolômicos e proteômicos de sng/dor.
3. Determinar o algoritmo da medicina de precisão para controle da dor/sng por meio dos marcadores genéticos.

2. Nos últimos anos, nossa equipe obteve algumas conquistas que justificam a busca de variantes genéticas para o desenvolvimento de um novo algoritmo de tratamento de feridas/dor.

1. A analgesia do LLLT é através do TRPV1.
2. A analgesia por ultrassom terapêutico é através do ASIC3.
3. A injeção de dextrose diminuiu a dor muscular crônica através do ASIC1a.
4. Biomarcador para sng/dor na fibromialgia.

3. Desenho do estudo

(1) Participantes da coorte A-Síndrome da dor miofascial: Recrutaremos 80 pacientes do Hospital Universitário Nacional de Taiwan e seu hospital filial.

A. Elegibilidade do paciente:

1. Critérios de inclusão: (1) Idade entre 18 e 100 anos. (2) VAS>=30 ou VAS>=30 a 4 kg de pressão (3) Diagnosticados como pacientes com síndrome de dor miofascial e dispostos a receber tratamento (incluindo LLLT, ultrassom terapêutico e terapia de injeção local de dextrose). O diagnóstico de MPS foi confirmado pelo Pesquisador Principal utilizando os critérios de faixa tensa, ponto-gatilho e dor irradiada.
2. Critérios de exclusão: Foram excluídos aqueles com infecção ativa, malignidade e doenças hematológicas. Os pacientes que receberam injeção local no trapézio superior dentro de 6 meses também são excluídos.

B. Desenho do estudo:

1. Após a obtenção do consentimento informado, são coletados os dados demográficos básicos, incluindo idade, sexo, emprego, nível de escolaridade e histórico médico dos pacientes elegíveis.
2. Os pacientes elegíveis receberam primeiro LLLT com comprimento de onda de 685 nm e potência de 30 mW (BTL-5000 Laser, BTL, Stevenage, Reino Unido) em densidades de energia de 8 J/cm2 no ponto-gatilho do músculo trapézio superior. A dor VAS pré e pós-tratamento e VAS-sng são coletados para determinação do fenótipo LLLT, respectivamente.
3. Em seguida, eles são convenientemente divididos em dois grupos (40 indivíduos em cada grupo): A. grupo ultrassom terapêutico; B. grupo de proloterapia. O Grupo A recebe ultrassom terapêutico de 1 MHz por 5 minutos com uma frequência de 2 a 3 vezes por semana no músculo trapézio superior dolorido. O Grupo B recebe proloterapia hipertônica no perimísio do músculo trapézio superior. O injetável é 5ml de solução de dextrose a 5%. Para garantir que a agulha não estava num vaso sanguíneo, a agulha foi aspirada antes da injeção. O mesmo médico (o investigador principal) injeta todos os pacientes para evitar variabilidade entre médicos. Nenhum outro medicamento ou modalidade física foi administrado para evitar interferência na eficácia em ambos os grupos.
4. Os pacientes recrutados recebem avaliação antes e depois da injeção e 2 semanas após a injeção. O resultado primário é VAS-dor e VAS-sng (escala visual analógica) com pontuação de 0-100, onde 100 é o valor que representa o maior grau de dor. Os resultados secundários são limiar de dor, tônus ​​​​muscular e SF-36 - um questionário composto por 36 itens e 8 domínios que abordam a percepção do paciente sobre sua QV (qualidade de vida). Amostras de sangue venoso e urina foram coletadas na primeira visita e na visita de 2 semanas, respectivamente. As amostras de sangue foram etiquetadas com número de identificação anônimo, centrifugadas e armazenadas a -80 ºC em freezer trancado até o momento do processamento futuro. A camada leucocitária é separada após a centrifugação e também armazenada. As amostras de urina foram aliquotadas e armazenadas a -80 ºC em freezer trancado para futuras análises.
5. Terapia de resgate (tratamento cruzado): Se o participante não estiver satisfeito com o tratamento da primeira rodada e a melhora da VAS for inferior a 10, então ele será elegível para receber a terapia de resgate - o tratamento no outro grupo. E eles retornarão à clínica por mais 2 semanas. As variáveis ​​​​de resultado também serão coletadas na 3ª visita.

(2) Participantes da coorte B-escoliose idiopática: Recrutaremos 80 pacientes do Hospital Universitário Nacional de Taiwan e seu hospital filial, e do Hospital Veterano de Taichung.

A. Elegibilidade do paciente:

1. Critérios de inclusão: (1) Idade entre 10-65 anos. (2) Diagnosticada como escoliose idiopática O diagnóstico de escoliose foi confirmado por radiografia simples ântero-posterior com ângulo de Cobbs maior que 10 graus.
2. Critérios de exclusão: (1) Foram excluídos aqueles com infecção ativa, malignidade e doenças hematológicas. (2) Aqueles com etiologias específicas de escoliose, incluindo escoliose congênita devido a malformação ou segmentação defeituosa das vértebras e escoliose neuromuscular devido a desequilíbrio muscular, escoliose sindrômica ou escoliose degenerativa.

B. Desenho do estudo:

1. Após a obtenção do consentimento informado, são coletados os dados demográficos básicos, incluindo idade, sexo, emprego, nível de escolaridade, nível de atividade física e histórico médico dos pacientes elegíveis.
2. Os pacientes recrutados recebem avaliação apenas uma vez. Os parâmetros coletados incluem ângulo de Cobb, ângulo de rotação da coluna, VAS-dor e VAS-sng (escala visual analógica) com pontuação de 0-100, onde 100 é o valor que representa o maior grau de dor, limiar de dor (Park, Kim et al. 2011), força e tônus ​​do músculo paraespinhal, e o questionário SF-36-a consiste em 36 itens e 8 domínios que abordam a percepção do paciente sobre sua QV (qualidade de vida) (Li, Wang et al. 2003). Amostras de sangue venoso e urina também foram coletadas. As amostras de sangue foram etiquetadas com número de identificação anônimo, centrifugadas e armazenadas a -80 ºC em freezer trancado até o momento do processamento futuro. A camada leucocitária é separada após a centrifugação e também armazenada. As amostras de urina foram aliquotadas e armazenadas a -80 ºC em freezer trancado para futuras análises.

(3) Extração de DNA e sequenciamento e genotipagem baseados em NGS O DNA genômico será extraído de células mononucleares do sangue periférico dos participantes usando o kit Gentra Puregene seguindo o protocolo do fabricante (Qiagen, Hilden, Mettmann, Alemanha), e submetido a agarose gel e O.D. testes de proporção para confirmar sua pureza e concentração. O DNA será fragmentado utilizando Covaris (Covaris, Woburn, MA, EUA), visando o comprimento do pico de 800 pb. As bibliotecas Illumina serão geradas a partir de gDNA usando o kit de preparação de biblioteca TruSeq (Illumina, San Diego, CA, EUA).

As sondas de captura de DNA serão personalizadas para atingir TRPV1, ASIC1a, ASIC3, Tac1, COMT, TCL1A, POMC e RGS4, e serão sintetizadas usando o protocolo Roche KAPA HyperChoice (Roche, Madison, WI, EUA). Todas as regiões codificantes e regiões não codificantes (promotores, íntrons, regiões 5' e 3' não traduzidas) destes 8 genes serão incluídas.

O enriquecimento da região alvo NGS será aplicado para enriquecer/capturar a região alvo (~148 Kb). As bibliotecas enriquecidas serão então sequenciadas usando Illumina MiSeq para gerar leituras emparelhadas de 300 pb. A profundidade esperada das regiões visadas será de 200x em média.

As análises de dados serão realizadas conforme descrito anteriormente. Resumidamente, os dados brutos de sequenciamento serão alinhados ao genoma humano de referência (Fev. 2009, GRCh37/hg19) usando BWA-MEM. Usaremos Picard para realizar a conversão, classificação e indexação de dados necessária. O principal processo de chamada de variantes, tanto para variantes de nucleotídeo único quanto para indels, será operado com o pacote de software GATK. Variantes estruturais também serão identificadas. Aplicaremos ANNOVAR para anotar adequadamente as variantes genéticas; isso inclui pelo menos anotação genética, anotação de alteração de aminoácidos, pontuações SIFT, pontuação PolyPhen2, identificadores dbSNP, frequências alélicas do Projeto Genoma 1000, frequências alélicas gnomAD e banco de dados ClinVar com significado clínico variante. Usaremos então o IGV para visualizar o mapeamento e anotação de sequências em uma interface gráfica.

As frequências alélicas das variantes de interesse serão comparadas entre diferentes grupos de participantes. Procuraremos possíveis variantes raras com efeitos muito fortes (o modelo de gene único), bem como variantes relativamente comuns com efeitos moderados a fortes (o modelo de fenótipo complexo).