Precizní medicína pro nocicepci, sngcepci a propriocepci.

Precizní medicína je definována jako „vznikající přístup k léčbě a prevenci nemocí, který bere v úvahu individuální variabilitu v genech, prostředí a životním stylu každého člověka“ organizací Precision Medicine Initiative.

Bolest je definována jako „nepříjemný smyslový a emocionální zážitek spojený se skutečným nebo potenciálním poškozením tkáně nebo popsaný z hlediska takového poškození“ Mezinárodní asociací pro studium bolesti (IASP). Tradičně je bolestivost nebo bolestivost také zahrnuta jako jeden z pocitů bolesti. Nedávno jsme definovali sngcepci jako pocit kyselosti a/nebo bolestivosti v somatosenzorickém systému a odhalili jsme, že analgezie ve svalu je prostřednictvím substance P a Tac1.

Podle klinického výsledku někteří pacienti dobře reagovali na fyzikální látky a někteří preferovali injekce. Genetické varianty výše uvedených genů mohou být určujícími faktory rozdílných terapeutických účinků. Trvalo však asi 4–8 týdnů, než pacient přešel z jedné možnosti léčby na jinou. Pokud dokážeme určit optimální léčebnou modalitu pomocí genetických biomarkerů, průběh léčby a celková rozloha se velmi zmenší.

Předpokládáme, že genetické varianty navržených genů (TRPV1, ASIC1a, ASIC3, Tac1, COMT, TCL1A, POMC, RGS4, ASIC2, ASIC4, TRPA1, NK1R, G2A, GPR4, OGR1, TDEKAG8, TASK1, TASK2, TASK3, TR , P2X2, P2X3, P2X5, TRPV4, KCNK1, NTSR1, NTSR2, CaV3.2, Nav1.1, Piezo1 a Piezo2, Runx3 nebo Egr3, endotelin konvertující enzym podobný 1 (ECEL1), geny těžkého řetězce myosinu MYH3 a MYH8 gen pro protein C vázající myosin, MYBPC1 a TNNI2, TNNT3 a TPM2, které kódují svalové regulační proteiny troponin I, troponin T a beta-tropomyosin) by mohly být prognostickými biomarkery léčby sng/bolesti nebo proprioceptivní funkce.

1.Konkrétní cíle

1. Vytvořit přístup založený na sekvenování nové generace (NGS) k nalezení genetických variant, které mohou určovat odpověď na způsoby léčby sng/bolesti a fenotyp idiopatické skoliózy.
2. Najít možné metabolomické a proteomické markery sng/bolesti.
3. Stanovit algoritmus precizní medicíny pro kontrolu sng/bolesti pomocí genetických markerů.

2. V minulých letech náš tým dosáhl určitých úspěchů, které ospravedlnily hledání genetických variant pro vývoj nového algoritmu léčby bolesti.

1. Analgezie LLLT je prostřednictvím TRPV1.
2. Analgezie terapeutickým ultrazvukem je přes ASIC3.
3. Injekce dextrózy snížila chronickou bolest svalů prostřednictvím ASIC1a.
4. Biomarker pro sng/bolest u fibromyalgie.

3. Design studie

(1) Účastníci z kohorty A-myofasciálního bolestivého syndromu: Přijmeme 80 pacientů z National Taiwan University Hospital a její pobočky.

A. Způsobilost pacienta:

1. Kritéria zařazení: (1) Věk mezi 18-100 lety. (2) VAS>=30 nebo VAS>=30 při tlaku 4 kg. (3) Diagnostikováni jako pacienti se syndromem myofasciální bolesti a ochotní podstoupit léčbu (včetně LLLT, terapeutického ultrazvuku a lokální injekční terapie dextrózou). Diagnóza MPS byla potvrzena hlavním zkoušejícím pomocí kritérií napjatého pruhu, spouštěcího bodu a vyzařující bolesti.
2. Kritéria vyloučení: Vyloučeni byli ti, kteří měli aktivní infekci, malignitu a hematologická onemocnění. Pacienti, kteří dostali lokální injekci do horního trapézu během 6 měsíců, jsou také vyloučeni.

B. Návrh studie:

1. Po získání informovaného souhlasu jsou shromážděny základní demografické údaje, včetně věku, pohlaví, zaměstnání, úrovně vzdělání a minulé lékařské historie způsobilých pacientů.
2. Způsobilí pacienti nejprve dostali LLLT s vlnovou délkou 685 nm a výkonem 30 mW (BTL-5000 Laser, BTL, Stevenage, Velká Británie) při hustotě energie 8 J/cm2 ve spouštěcím bodě horního trapézového svalu. Bolest VAS a VAS-sng před léčbou a po léčbě se shromažďují pro stanovení fenotypu LLLT.
3. Poté jsou vhodně rozděleni do dvou skupin (40 subjektů v každé skupině): A. skupina pro terapeutický ultrazvuk; B. proloterapeutická skupina. Skupina A přijímá 1 MHz terapeutický ultrazvuk po dobu 5 minut s frekvencí 2-3krát týdně na bolestivý horní trapézový sval. Skupina B dostává hypertonickou proloterapii v perimysiu horního trapézového svalu. Injekční prostředek je 5 ml 5% roztoku dextrózy. Aby se zajistilo, že jehla nebyla v krevní cévě, byla jehla před injekcí odsáta. Stejný lékař (hlavní zkoušející) podává injekci všem pacientům, aby se předešlo variabilitě mezi lékaři. Nebyla podána žádná jiná medikace nebo fyzikální modalita, aby se předešlo interferenci v účinnosti v obou skupinách.
4. Rekrutovaní pacienti dostanou hodnocení před a po injekci a 2 týdny po injekci. Primárním výsledkem je VAS-pain a VAS-sng (vizuální analogová škála) se skóre 0-100, kde 100 je hodnota představující nejvyšší stupeň bolesti. Sekundárními výstupy jsou práh bolesti, svalový tonus a dotazník SF-36-a sestává z 36 položek a 8 domén, které řeší pacientovo vnímání jejich QoL (kvalita života). Vzorky žilní krve a moči byly odebrány při první návštěvě a 2týdenní návštěvě. Vzorky krve byly označeny anonymizovaným ID číslem, odstředěny a skladovány při -80 ºC v uzamčeném mrazáku až do doby budoucího zpracování. Buffy coat se po centrifugaci oddělí a také uskladní. Vzorky moči byly rozděleny na alikvoty a skladovány při -80 °C v uzamčeném mrazáku pro budoucí analýzu.
5. Záchranná terapie (zkřížená léčba): Pokud účastník není spokojen s léčbou v prvním kole a zlepšení VAS je menší než 10, pak má nárok na záchrannou terapii – léčbu v druhé skupině. A vrátí se na kliniku na další 2 týdny. Výsledné proměnné budou shromážděny také při 3. návštěvě.

(2) Účastníci z kohorty B-idiopatické skoliózy: Přijmeme 80 pacientů z National Taiwan University Hospital a její pobočky a Taichung Veteran Hospital.

A. Způsobilost pacienta:

1. Kritéria pro zařazení: (1) Věk mezi 10-65 lety. (2) Diagnostikována jako idiopatická skolióza Diagnóza skoliózy byla potvrzena předozadním prostým rentgenovým snímkem s Cobbsovým úhlem větším než 10 stupňů.
2. Kritéria vyloučení: (1) Ti, kteří mají aktivní infekci, malignitu a hematologická onemocnění, byli vyloučeni. (2) Ti, kteří mají specifickou etiologii skoliózy, včetně vrozené skoliózy způsobené malformací nebo vadnou segmentací obratlů a neuromuskulární skoliózy způsobené svalovou nerovnováhou, syndromickou skoliózou nebo degenerativní skoliózou.

B. Návrh studie:

1. Po získání informovaného souhlasu jsou shromážděny základní demografické údaje, včetně věku, pohlaví, zaměstnání, úrovně vzdělání, úrovně fyzické aktivity a anamnézy způsobilých pacientů.
2. Rekrutovaní pacienti obdrží hodnocení pouze jednou. Shromážděné parametry zahrnují Cobbův úhel, rotační úhel páteře, VAS-pain a VAS-sng (vizuální analogová stupnice) se skóre 0-100, kde 100 je hodnota představující nejvyšší stupeň bolesti, práh bolesti (Park, Kim et al. 2011), síla a tonus paraspinálního svalu a dotazník SF-36-a se skládá z 36 položek a 8 domén, které řeší pacientovo vnímání jejich QoL (kvalita života) (Li, Wang et al. 2003). Byly také odebrány vzorky žilní krve a moči. Vzorky krve byly označeny anonymizovaným ID číslem, odstředěny a skladovány při -80 ºC v uzamčeném mrazáku až do doby budoucího zpracování. Buffy coat se po centrifugaci oddělí a také uskladní. Vzorky moči byly rozděleny na alikvoty a skladovány při -80 °C v uzamčeném mrazáku pro budoucí analýzu.

(3) Extrakce DNA a sekvenování a genotypizace na bázi NGS Genomová DNA bude extrahována z mononukleárních buněk periferní krve účastníků pomocí soupravy Gentra Puregene podle protokolu výrobce (Qiagen, Hilden, Mettmann, Německo) a podrobena agaróze. gel a O.D. poměrové testy k potvrzení jeho čistoty a koncentrace. DNA bude fragmentována pomocí Covaris (Covaris, Woburn, MA, USA) s cílem dosáhnout maximální délky 800 bp. Knihovny Illumina budou generovány z gDNA pomocí soupravy TruSeq Library Preparation Kit (Illumina, San Diego, CA, USA).

Sondy pro zachycení DNA budou na zakázku navrženy tak, aby cílily na TRPV1, ASIC1a, ASIC3, Tac1, COMT, TCL1A, POMC a RGS4 a budou syntetizovány pomocí protokolu Roche KAPA HyperChoice (Roche, Madison, WI, USA). Budou zahrnuty všechny kódující oblasti a nekódující oblasti (promotory, introny, 5' a 3' netranslatované oblasti) těchto 8 genů.

Obohacení cílové oblasti NGS bude použito k obohacení/zachycení cílové oblasti (~148 Kb). Obohacené knihovny pak budou sekvenovány pomocí Illumina MiSeq, aby se vygenerovaly čtení párového konce o 300 bp. Očekávaná hloubka cílových oblastí bude v průměru 200x.

Analýzy dat budou provedeny tak, jak bylo popsáno dříve. Stručně řečeno, nezpracovaná sekvenační data budou porovnána s referenčním lidským genomem (únor. 2009, GRCh37/hg19) pomocí BWA-MEM. Picard použijeme k provedení nezbytné konverze dat, třídění a indexování. Proces volání hlavní varianty, jak pro jednonukleotidové varianty, tak pro indely, bude provozován se softwarovým balíčkem GATK. Budou identifikovány i konstrukční varianty. Použijeme ANNOVAR, abychom vhodně anotovali genetické varianty; to zahrnuje alespoň genovou anotaci, anotaci změny aminokyselin, skóre SIFT, skóre PolyPhen2, identifikátory dbSNP, frekvence alel 1000 Genome Project, frekvence alel gnomAD a databázi ClinVar s variantním klinickým významem. IGV pak použijeme k zobrazení mapování a anotací sekvencí na grafickém rozhraní.

Frekvence alel zájmových variant budou porovnány mezi různými skupinami účastníků. Budeme hledat možné vzácné varianty s velmi silnými účinky (model jednoho genu) i relativně běžné varianty se středními až silnými účinky (model komplexního fenotypu).