Medicina di precisione per nocicezione, sensibilità e propriocezione.

La medicina di precisione è definita come “un approccio emergente per il trattamento e la prevenzione delle malattie che tiene conto della variabilità individuale dei geni, dell’ambiente e dello stile di vita di ogni persona” dalla Precision Medicine Initiative.

Il dolore è definito come "un'esperienza sensoriale ed emotiva spiacevole associata a danno tissutale reale o potenziale o descritta in termini di tale danno" dall'Associazione Internazionale per lo Studio del Dolore (IASP). Tradizionalmente, anche il dolore, o sng, è incluso come una delle sensazioni di dolore. Recentemente, abbiamo definito la percezione come sensazione di acido e/o dolore nel sistema somatosensoriale e abbiamo rivelato che l'analgesia nel muscolo avviene attraverso la sostanza P e Tac1.

Secondo l'esito clinico, alcuni pazienti hanno risposto bene agli agenti fisici e alcuni hanno preferito le iniezioni. Le varianti genetiche dei geni sopra menzionati potrebbero essere i fattori determinanti degli effetti terapeutici differenziali. Tuttavia, erano necessarie circa 4-8 settimane affinché un paziente passasse da un’opzione di trattamento a un’altra. Se riusciamo a determinare la modalità di trattamento ottimale mediante biomarcatori genetici, il corso del trattamento e la portata totale diminuiranno notevolmente.

Ipotizziamo che le varianti genetiche dei geni proposti (TRPV1, ASIC1a, ASIC3, Tac1, COMT, TCL1A, POMC, RGS4, ASIC2, ASIC4, TRPA1, NK1R, G2A, GPR4, OGR1, TDAG8, TASK1, TASK2, TASK3, TREK1 , P2X2, P2X3, P2X5, TRPV4, KCNK1, NTSR1, NTSR2, CaV3.2, Nav1.1, Piezo1 e Piezo2, Runx3 o Egr3, enzima di conversione dell'endotelina 1 (ECEL1), geni della catena pesante della miosina MYH3 e MYH8, gene della proteina C legante la miosina, MYBPC1 e TNNI2, TNNT3 e TPM2 che codificano per le proteine ​​regolatrici muscolari troponina I, troponina T e beta-tropomiosina) potrebbero essere i biomarcatori prognostici dei trattamenti sng/dolore o della funzione propriocettiva.

1.Obiettivi specifici

1. Mettere a punto un approccio basato sul sequenziamento di prossima generazione (NGS) per trovare varianti genetiche che possano determinare la risposta delle modalità di trattamento del dolore/sng e il fenotipo della scoliosi idiopatica.
2. Individuare possibili marcatori metabolomici e proteomici del dolore/sng.
3. Determinare l'algoritmo della medicina di precisione per il controllo del dolore e del dolore tramite i marcatori genetici.

2. Negli ultimi anni, il nostro team ha ottenuto alcuni risultati tali da giustificare la ricerca di varianti genetiche per lo sviluppo di un nuovo algoritmo per il trattamento della ferita/dolore.

1. L'analgesia della LLLT avviene attraverso TRPV1.
2. L'analgesia mediante ultrasuoni terapeutici avviene tramite ASIC3.
3. L’iniezione di destrosio ha ridotto il dolore muscolare cronico attraverso ASIC1a.
4. Biomarcatore per dolore/sng nella fibromialgia.

3.Progettazione dello studio

(1) Partecipanti della coorte Sindrome del dolore miofasciale A: recluteremo 80 pazienti dal National Taiwan University Hospital e dal suo ospedale distaccato.

A. Idoneità del paziente:

1. Criteri di inclusione: (1) Età compresa tra 18 e 100 anni. (2) VAS>=30 o VAS>=30 a una pressione di 4 kg (3) Diagnosi di pazienti con sindrome del dolore miofasciale e disposti a ricevere il trattamento (inclusi LLLT, ultrasuoni terapeutici e terapia iniettiva locale di destrosio). La diagnosi di MPS è stata confermata dal ricercatore principale utilizzando i criteri della banda tesa, del punto trigger e del dolore irradiato.
2. Criteri di esclusione: sono stati esclusi coloro che presentavano infezioni attive, tumori maligni e malattie ematologiche. Sono stati esclusi anche i pazienti che avevano ricevuto un'iniezione locale nel trapezio superiore entro 6 mesi.

B. Progettazione dello studio:

1. Dopo aver ottenuto il consenso informato, vengono raccolti i dati demografici di base, tra cui età, sesso, lavoro, livello di istruzione e storia medica passata dei pazienti idonei.
2. I pazienti idonei hanno prima ricevuto LLLT con una lunghezza d'onda di 685 nm e un'uscita di 30 mW (laser BTL-5000, BTL, Stevenage, Regno Unito) a densità di energia di 8 J/cm2 nel punto di innesco del muscolo trapezio superiore. I valori VAS-pain e VAS-sng pre e post trattamento vengono raccolti rispettivamente per la determinazione del fenotipo LLLT.
3. Successivamente vengono opportunamente assegnati in due gruppi (40 soggetti per gruppo): A. gruppo ecografia terapeutica; B. gruppo di proloterapia. Il gruppo A riceve ultrasuoni terapeutici da 1 MHz per 5 minuti ad una frequenza di 2-3 volte a settimana sul muscolo trapezio superiore dolorante. Il gruppo B riceve la proloterapia ipertonica al perimisio del muscolo trapezio superiore. L'iniettante è una soluzione di destrosio al 5% da 5 ml. Per garantire che l'ago non fosse in un vaso sanguigno, l'ago è stato aspirato prima dell'iniezione. Lo stesso medico (il ricercatore principale) effettua l'iniezione in tutti i pazienti per evitare variabilità tra medici. Nessun altro farmaco o modalità fisica è stata somministrata per evitare interferenze sull'efficacia in entrambi i gruppi.
4. I pazienti reclutati ricevono una valutazione prima e dopo l'iniezione e 2 settimane dopo l'iniezione. L'esito primario è il dolore VAS e VAS-sng (scala analogica visiva) con un punteggio compreso tra 0 e 100, dove 100 è il valore che rappresenta il grado più alto di dolore. I risultati secondari sono la soglia del dolore, il tono muscolare e il questionario SF-36, un questionario composto da 36 elementi e 8 domini che affrontano la percezione del paziente della propria QoL (qualità della vita). Campioni di sangue venoso e di urina sono stati raccolti rispettivamente alla prima visita e alla visita di 2 settimane. I campioni di sangue sono stati etichettati con un numero ID anonimo, centrifugati e conservati a -80 ºC in un congelatore chiuso fino al momento della successiva elaborazione. Il buffy coat viene separato dopo la centrifugazione e anche conservato. I campioni di urina sono stati suddivisi in aliquote e conservati a -80 ºC in un congelatore chiuso a chiave per analisi future.
5. Terapia di salvataggio (trattamento incrociato): se il partecipante non è soddisfatto del primo ciclo di trattamento e il miglioramento della VAS è inferiore a 10, è idoneo a ricevere la terapia di salvataggio, il trattamento nell'altro gruppo. E torneranno in clinica per altre 2 settimane. Le variabili di esito verranno raccolte anche nella 3a visita.

(2) Partecipanti dalla coorte B-scoliosi idiopatica: recluteremo 80 pazienti dal National Taiwan University Hospital e dal suo ospedale distaccato e dal Taichung Veteran Hospital.

A. Idoneità del paziente:

1. Criteri di inclusione: (1) Età compresa tra 10 e 65 anni. (2) Diagnosi come scoliosi idiopatica La diagnosi di scoliosi è stata confermata mediante radiografia semplice antero-posteriore con angolo di Cobbs maggiore di 10 gradi.
2. Criteri di esclusione: (1) Sono stati esclusi coloro che presentavano infezioni attive, tumori maligni e malattie ematologiche. (2) Coloro che presentano eziologie specifiche di scoliosi, compresa la scoliosi congenita dovuta a malformazione o segmentazione difettosa delle vertebre e la scoliosi neuromuscolare dovuta a squilibrio muscolare, scoliosi sindromica o scoliosi degenerativa.

B. Progettazione dello studio:

1. Dopo aver ottenuto il consenso informato, vengono raccolti i dati demografici di base, tra cui età, sesso, lavoro, livello di istruzione, livello di attività fisica e storia medica passata dei pazienti idonei.
2. I pazienti reclutati ricevono la valutazione una sola volta. I parametri raccolti includono l'angolo di Cobb, l'angolo di rotazione della colonna vertebrale, VAS-pain e VAS-sng (scala analogica visiva) con un punteggio da 0 a 100, dove 100 è il valore che rappresenta il grado più alto di dolore, soglia del dolore (Park, Kim et al. 2011), forza e tono dei muscoli paraspinali, e il questionario SF-36-a è composto da 36 item e 8 domini che riguardano la percezione del paziente della propria QoL (qualità della vita) (Li, Wang et al. 2003). Sono stati inoltre raccolti campioni di sangue venoso e di urina. I campioni di sangue sono stati etichettati con un numero ID anonimo, centrifugati e conservati a -80 ºC in un congelatore chiuso fino al momento della successiva elaborazione. Il buffy coat viene separato dopo la centrifugazione e anche conservato. I campioni di urina sono stati suddivisi in aliquote e conservati a -80 ºC in un congelatore chiuso a chiave per analisi future.

(3) Estrazione del DNA, sequenziamento e genotipizzazione basati su NGS Il DNA genomico verrà estratto dalle cellule mononucleari del sangue periferico dei partecipanti utilizzando il kit Gentra Puregene seguendo il protocollo del produttore (Qiagen, Hilden, Mettmann, Germania) e sottoposto ad agarosio gel e O.D. test di rapporto per confermarne la purezza e la concentrazione. Il DNA verrà frammentato utilizzando Covaris (Covaris, Woburn, MA, USA), puntando alla lunghezza del picco di 800 bp. Le librerie Illumina verranno generate da gDNA utilizzando il kit di preparazione delle librerie TruSeq (Illumina, San Diego, CA, USA).

Le sonde per la cattura del DNA saranno progettate su misura per colpire TRPV1, ASIC1a, ASIC3, Tac1, COMT, TCL1A, POMC e RGS4 e saranno sintetizzate utilizzando il protocollo Roche KAPA HyperChoice (Roche, Madison, WI, USA). Verranno incluse tutte le regioni codificanti e non codificanti (promotori, introni, regioni 5' e 3' non tradotte) di questi 8 geni.

L'arricchimento della regione target NGS verrà applicato per arricchire/catturare la regione target (~148 Kb). Le librerie arricchite verranno quindi sequenziate utilizzando Illumina MiSeq per generare letture accoppiate di 300 bp. La profondità prevista delle regioni target sarà in media di 200x.

Le analisi dei dati verranno eseguite come descritto in precedenza. In breve, i dati grezzi di sequenziamento saranno allineati al genoma umano di riferimento (febbraio 2019). 2009, GRCh37/hg19) utilizzando BWA-MEM. Utilizzeremo Picard per eseguire la conversione, l'ordinamento e l'indicizzazione dei dati necessari. Il principale processo di identificazione delle varianti, sia per le varianti a singolo nucleotide che per le indel, sarà gestito con il pacchetto software GATK. Verranno inoltre individuate varianti strutturali. Applicheremo ANNOVAR per annotare opportunamente le varianti genetiche; ciò include almeno l'annotazione del gene, l'annotazione del cambiamento dell'amminoacido, i punteggi SIFT, il punteggio PolyPhen2, gli identificatori dbSNP, le frequenze alleliche del progetto Genome 1000, le frequenze alleliche gnomAD e il database ClinVar con significato clinico variante. Utilizzeremo quindi IGV per visualizzare la mappatura e l'annotazione delle sequenze su un'interfaccia grafica.

Le frequenze alleliche delle varianti di interesse verranno confrontate tra diversi gruppi di partecipanti. Cercheremo possibili varianti rare con effetti molto forti (il modello a singolo gene) così come varianti relativamente comuni con effetti da moderati a forti (il modello del fenotipo complesso).