Triagem lipidômica de drogas anti-inflamatórias e candidatos a drogas in vitro - Parte A

Os anti-inflamatórios não esteróides (AINEs), seletivos para a inibição da ciclooxigenase (COX)-2, aliviam a dor e a inflamação suprimindo a prostaciclina derivada da COX-2 (PGI2) e a prostaglandina (PG) E2 (1). No entanto, oito ensaios clínicos controlados por placebo revelaram que os AINEs, concebidos para inibir especificamente a COX-2, predispõem os doentes a riscos cardiovasculares aumentados, incluindo enfarte do miocárdio, acidente vascular cerebral, hipertensão pulmonar e sistémica, insuficiência cardíaca congestiva e morte cardíaca súbita (1-3 ). Os efeitos adversos cardiovasculares são atribuíveis à supressão do PGI2 derivado da COX-2, um potente vasodilatador e inibidor da ativação plaquetária (4; 5). Nosso laboratório demonstrou que a deleção global, inibição seletiva ou mutação de COX-2 ou deleção do receptor para PGI2 elevam a pressão sanguínea e aceleram a trombogênese em modelos de camundongos (6). Demonstramos ainda que a deleção vascular de COX-2 predispõe camundongos a trombose e hipertensão (7), e que a deleção seletiva de COX-2 em cardiomiócitos leva a disfunção cardíaca e maior suscetibilidade à arritmogênese induzida (8) que pode contribuir para a insuficiência cardíaca e arritmias cardíacas relatadas em pacientes tomando AINEs específicos para inibição de COX-2.

Este risco cardiovascular dos AINEs despertou o interesse na prostaglandina E sintase-1 microssomal (mPGES-1) como um alvo alternativo de drogas. mPGES-1 é a sintase terminal PG induzível que atua a jusante da COX-2 e catalisa a conversão do produto endoperóxido COX intermediário PGH2 em PGE2 (9). Relatamos anteriormente que, semelhante à interferência com a expressão ou função de COX-2, a deleção global ou específica da célula de mPGES-1 suprime a produção de PGE2; mas diferentemente da COX-2, a deficiência global de mPGES-1 aumenta a biossíntese de PGI2 e não predispõe camundongos normo ou hiperlipidêmicos a eventos trombogênicos ou hipertensivos (9-11). Tanto a supressão de PGE2 quanto o aumento de PGI2 em camundongos mPGES-1-/- resultam da rediversão do substrato de PGH2 acumulado para PGI2 sintase (10). Além disso, a deleção global de mPGES-1 limita a resposta proliferativa vascular à lesão por fio (12), retarda a aterogênese e suprime a formação de aneurisma da aorta abdominal induzida por angiotensina II em camundongos hiperlipidêmicos (10; 13). Também mostramos que a deficiência de mPGES-1 não afeta a inflamação das vias aéreas induzida por ozônio ou a hiperresponsividade das vias aéreas, sugerindo que a inibição farmacológica de mPGES-1 e a rediversão de endoperóxido para PGD2 podem não predispor pacientes em risco de disfunção das vias aéreas (14). Além disso, estudos de outros indicam que a deleção global de mPGES-1 reduz o infarto cerebral pós-isquêmico e a disfunção neurológica na isquemia/reperfusão cerebral em camundongos (15). A deficiência de mPGES-1 também torna os camundongos menos suscetíveis à inflamação excessiva e hipersensibilidade em modelos de analgesia em roedores (16; 17). Tomados em conjunto, esses achados sugerem que a inibição farmacológica de mPGES-1 pode reter os efeitos antiinflamatórios da supressão de PGE2, mas devido ao aumento de PGI2, o direcionamento de mPGES-1 pode evitar os riscos cardiovasculares associados aos inibidores seletivos de COX-2.

A rediversão do substrato PGH2 consequente à deleção de mPGES-1 é um evento ubíquo observado no nível celular e sistemicamente (metabólitos da prostaglandina urinária); o perfil dos produtos de rediversão, no entanto, varia de acordo com o tipo de célula e tecido, o modelo da doença e a extensão da perturbação do sistema (6; 10-14; 18-21). Mostramos que em camundongos deficientes em mPGES-1 em células endoteliais (EC) ou células musculares lisas vasculares (VSMC), PGI2 é o produto de rediversão de substrato predominante, enquanto a deleção de mPGES-1 em células mielóides resulta em desvio de PGH2 principalmente para TxA2(11). Funcionalmente, camundongos sem mPGES-1 em células mielóides exibiram uma resposta pobre à lesão vascular implicando mPGES-1 mielóide como um alvo de drogas cardiovasculares. Portanto, a deleção de mPGES-1 específica da célula leva a um padrão diferencial de rediversão do substrato e pode afetar a função biológica do sistema, complicando assim o desenvolvimento de drogas. O que não se sabe é se a deleção genética ou a inibição farmacológica de mPGES-1 pode direta (através de rediversão de substrato) ou indiretamente (por efeitos de produtos de rediversão de prostaglandina na expressão enzimática ou seu metabolismo adicional para produtos transcelulares (22)) influenciar o lipidoma além da prostaglandina via com consequência funcional. Por exemplo, a interrupção do metabolismo AA-PGE2 pode influenciar a formação do produto araquidonato pelo citocromo P450 (23; 24), leucotrieno, anandamida, 2-araquidonilglicerol (2-AG) e outras cascatas (25). No nível celular, macrófagos mPGES-1-/-, pré-tratados com LPS e estimulados com ácido araquidônico (AA), exibem um aumento de 5 vezes em 12-HHT (ácido 12-hidroxiheptadecatrienoico), indicando rediversão do substrato para tromboxano A sintase ( 18). Foi relatado que a inibição e a deleção de COX-2 aumentam os metabólitos da via 5-lipoxigenase (5-LO) 5-HETE (ácido 5-hidroxieicosatetraenóico) e leucotrienos LTB4, LTC4, LTD4 (26-28) e metabólitos da cascata CYP450 14,15-DHET/EET (ácido dihidroxieicosatrienóico/epoxieicosatrienóico) (26). Portanto, o substrato AA pode ser desviado de uma via para outra quando um determinado ramo da cascata é inibido farmacologicamente ou eliminado geneticamente.

Aqui, conduziremos uma triagem lipidômica de amplo espectro de anti-inflamatórios e candidatos a medicamentos que antagonizam os receptores (receptores LTC4, LTB4, EP4) ou inibem componentes específicos (COX-1, COX-2, mPGES-1, 5-KO , FLAP, LTA4A) da via do ácido araquidônico em um ensaio in vitro de sangue total humano (hWBA). Voluntários saudáveis, não fumantes, homens e mulheres serão convidados a doar sangue. Os ensaios de sangue total humano incluirão (i) determinação dos níveis lipídicos basais em vários pontos de tempo em sangue total estimulado, (ii) medição de lipídios em sangue total pré-estimulado tratado com um único composto de intervenção, (iii) quantificação de lipídios em sangue total pré-estimulado tratado com uma combinação de compostos de intervenção. Esperamos que os compostos em foco afetem várias vias inflamatórias, resultando em novos padrões de rediversão de substrato e medição de produtos lipídicos anteriormente desconhecidos.