Screening lipidomico di farmaci antinfiammatori e farmaci candidati in vitro - Parte A

I farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS), selettivi per l'inibizione della cicloossigenasi (COX)-2, alleviano il dolore e l'infiammazione sopprimendo la prostaciclina derivata dalla COX-2 (PGI2) e la prostaglandina (PG) E2 (1). Tuttavia, otto studi clinici controllati con placebo hanno rivelato che i FANS, progettati per inibire in modo specifico la COX-2, predispongono i pazienti a maggiori rischi cardiovascolari tra cui infarto miocardico, ictus, ipertensione sistemica e polmonare, insufficienza cardiaca congestizia e morte cardiaca improvvisa (1-3 ). Gli effetti avversi cardiovascolari sono attribuibili alla soppressione della PGI2 derivata dalla COX-2, un potente vasodilatatore e inibitore dell'attivazione piastrinica (4; 5). Il nostro laboratorio ha dimostrato che la delezione globale, l'inibizione selettiva o la mutazione di COX-2 o la delezione del recettore per PGI2 aumentano la pressione sanguigna e accelerano la trombogenesi nei modelli murini (6). Abbiamo inoltre dimostrato che la delezione vascolare di COX-2 predispone i topi a trombosi e ipertensione (7) e che la delezione selettiva di COX-2 nei cardiomiociti porta a disfunzione cardiaca e maggiore suscettibilità all'aritmogenesi indotta (8) che può contribuire allo scompenso cardiaco e aritmie cardiache riportate in pazienti che assumono FANS specifici per l'inibizione della COX-2.

Questo rischio cardiovascolare dei FANS ha suscitato interesse per la prostaglandina E sintasi-1 microsomiale (mPGES-1) come bersaglio farmacologico alternativo. mPGES-1 è la sintasi terminale PG inducibile che agisce a valle della COX-2 e catalizza la conversione del prodotto endoperossido COX intermedio PGH2 in PGE2 (9). In precedenza abbiamo riportato che, analogamente all'interferenza con l'espressione o la funzione di COX-2, la delezione globale o specifica per cellula di mPGES-1 sopprime la produzione di PGE2; ma a differenza di COX-2, il deficit globale di mPGES-1 aumenta la biosintesi di PGI2 e non predispone i topi normo- o iperlipidemici a eventi trombogenici o ipertensivi (9-11). Sia la soppressione di PGE2 che l'aumento di PGI2 nei topi mPGES-1-/- derivano dalla rediversione del substrato di PGH2 accumulato in PGI2 sintasi (10). Inoltre, la delezione globale di mPGES-1 limita la risposta proliferativa vascolare alla lesione del filo (12), ritarda l'aterogenesi e sopprime la formazione di aneurisma dell'aorta addominale indotto dall'angiotensina II nei topi iperlipidemici (10; 13). Abbiamo anche dimostrato che la carenza di mPGES-1 non influenza l'infiammazione delle vie aeree indotta dall'ozono o l'iper-reattività delle vie aeree, suggerendo che l'inibizione farmacologica di mPGES-1 e la rediversione dell'endoperossido a PGD2 potrebbero non predisporre i pazienti a rischio di disfunzione delle vie aeree (14). Inoltre, studi di altri indicano che la delezione globale di mPGES-1 riduce l'infarto cerebrale post-ischemico e la disfunzione neurologica nell'ischemia/riperfusione cerebrale nei topi (15). La carenza di mPGES-1 rende anche i topi meno suscettibili all'eccessiva infiammazione e all'ipersensibilità nei modelli di roditori di analgesia (16; 17). Presi insieme, questi risultati suggeriscono che l'inibizione farmacologica di mPGES-1 può mantenere gli effetti antinfiammatori dalla soppressione di PGE2, ma a causa dell'aumento di PGI2, il targeting di mPGES-1 potrebbe evitare i rischi cardiovascolari associati agli inibitori selettivi della COX-2.

La rediversione del substrato PGH2 conseguente alla delezione di mPGES-1 è un evento ubiquitario osservato a livello cellulare e sistemico (metaboliti delle prostaglandine urinarie); il profilo dei prodotti di rediversione, tuttavia, varia in base al tipo di cellula e tessuto, al modello di malattia e all'entità della perturbazione del sistema (6; 10-14; 18-21). Abbiamo dimostrato che nei topi carenti di mPGES-1 nelle cellule endoteliali (EC) o nelle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC), PGI2 è il prodotto predominante di rediversione del substrato, mentre la delezione di mPGES-1 nelle cellule mieloidi provoca uno shunt di PGH2 principalmente verso TxA2(11). Dal punto di vista funzionale, i topi privi di mPGES-1 nelle cellule mieloidi hanno mostrato una scarsa risposta alle lesioni vascolari che implicano la mPGES-1 mieloide come bersaglio di farmaci cardiovascolari. Pertanto, la delezione di mPGES-1 specifica per cellula porta a un modello differenziale di rediversione del substrato e può influenzare la funzione biologica del sistema, complicando così lo sviluppo di farmaci. Ciò che non è noto è se la delezione genetica o l'inibizione farmacologica di mPGES-1 possa influenzare direttamente (attraverso la rediversione del substrato) o indirettamente (mediante gli effetti dei prodotti di rediversione delle prostaglandine sull'espressione enzimatica o il loro ulteriore metabolismo in prodotti transcellulari (22)) il lipidoma oltre la prostaglandina percorso con conseguenze funzionali. Ad esempio, l'interruzione del metabolismo AA-PGE2 potrebbe influenzare la formazione del prodotto arachidonato da parte del citocromo P450 (23; 24), leucotriene, anandamide, 2-arachidonilglicerolo (2-AG) e altre cascate (25). A livello cellulare, i macrofagi mPGES-1-/-, pretrattati con LPS e stimolati con acido arachidonico (AA), mostrano un aumento di 5 volte del 12-HHT (acido 12-idrossieptadecatrienoico), indicando una rediversione del substrato verso il trombossano A sintasi. 18). È stato riportato che l'inibizione e la delezione di COX-2 aumentano i metaboliti della via 5-lipossigenasi (5-LO) 5-HETE (acido 5-idrossiicosatetraenoico) e i leucotrieni LTB4, LTC4, LTD4 (26-28) e i metaboliti della cascata CYP450 14,15-DHET/EET (acido diidrossiicosatrienoico/epossiicosatrienoico) (26). Pertanto, il substrato AA può essere deviato da un percorso all'altro quando un particolare ramo della cascata è farmacologicamente inibito o ablato geneticamente.

Qui, condurremo uno screening lipidomico ad ampio spettro di farmaci antinfiammatori e farmaci candidati che antagonizzano i recettori (recettori LTC4, LTB4, EP4) o inibiscono componenti specifici (COX-1, COX-2, mPGES-1, 5-KO , FLAP, LTA4A) della via dell'acido arachidonico in un test su sangue intero umano in vitro (hWBA). A volontari sani, non fumatori, maschi e femmine verrà chiesto di donare il sangue. Le analisi del sangue intero umano includeranno (i) la determinazione dei livelli lipidici di base in vari punti temporali nel sangue intero stimolato, (ii) la misurazione dei lipidi nel sangue intero pre-stimolato trattato con un singolo composto di intervento, (iii) la quantificazione dei lipidi nel sangue intero pre-stimolato trattato con una combinazione di composti di intervento. Ci aspettiamo che i composti in questione influenzeranno vari percorsi infiammatori risultando in nuovi modelli di reindirizzamento del substrato e misurazione di prodotti lipidici precedentemente sconosciuti.