Investigação da produção endógena e/ou exógena in vivo de metabólitos fenólicos usando metabolômica (des)direcionada (ENDOPHENOL)

O estudo consistirá em um ensaio cruzado randomizado e cada braço durará 5 dias. Um total de trinta (30) voluntários saudáveis ​​serão recrutados para o estudo em Parma (PR), por meio de anúncios colocados na universidade, hospital e locais públicos. Para alocar assuntos para cada braço, uma lista será gerada usando um desenho de blocos aleatórios usando Random Number Generator Pro (Segobit Software). Esta lista será cega para o PI e voluntários, pois será feita por um colega não envolvido na inscrição dos sujeitos e utilizando uma sequência numerada em envelopes lacrados e opacos.

Os voluntários que aceitarem livremente participar do estudo serão solicitados a fornecer seu consentimento informado por escrito. As informações aos voluntários serão fornecidas antes e separadamente do termo de consentimento. Estas fichas informativas e os formulários de consentimento informado foram elaborados de acordo com a Convenção de Oviedo e consideram o guia do Comitê de Ética local. Depois de obter o consentimento informado por escrito, os voluntários serão submetidos a uma visita de triagem para determinar a elegibilidade e coletar dados pessoais.

A privacidade dos voluntários será assegurada através da pseudoanonimização através da atribuição de um código alfanumérico pessoal. Os voluntários recrutados também assinarão uma autorização para uso das informações pessoais e dados recuperados.

Após o recrutamento, os sujeitos participarão de uma primeira visita, quando serão coletados dados pessoais e medidos os parâmetros de composição corporal e antropometria. Em seguida, receberão os alimentos, suplementos e materiais necessários para acompanhar o estudo. Os recrutados serão solicitados a seguir uma dieta pobre em (poli) fenol, que será a mesma para todos os voluntários e mantida durante todo o período do estudo de intervenção. Os alimentos, modo de preparo e horários de consumo das refeições serão fornecidos pelo patrocinador. A dieta será personalizada para aproximar as calorias necessárias com base na taxa metabólica basal medida, multiplicada pelo nível de atividade física definido em 1,45, e haverá variações quantitativas na dieta com baixo teor de (poli) fenol com base nas necessidades diárias de energia: 1.500 kcal/dia, 1.750 kcal/dia, 2.000 kcal/dia, 2.250 kcal/dia, 2.500 kcal/dia, 2.750 kcal/dia ou 3.000 kcal/dia, todos com quantidades nutricionalmente equilibradas de proteínas, gorduras e carboidratos. Além disso, os participantes serão solicitados a restringir os exercícios físicos durante a duração do estudo.

Os participantes serão solicitados a coletar a urina produzida nas 60 horas anteriores à intervenção, a partir da noite anterior ao primeiro dia de dieta (a partir das 21h00 da noite anterior ao primeiro dia de dieta) e a cada 12 horas (60-48h, 48-36h , 36-24h, 24-12h, 12-0h) e preencher o diário alimentar para verificar o cumprimento da dieta. Os participantes são solicitados a trazer a urina coletada para a Unidade de Nutrição Humana do Departamento de Alimentos e Medicamentos da Universidade de Parma.

Na manhã do terceiro dia de dieta, os sujeitos serão solicitados a chegar à Universidade de Parma em jejum. Antes de receber a intervenção, amostras de urina e saliva em jejum serão coletadas. Em seguida, será fornecido café descafeinado açucarado (3 doses de 50 mL cada e 5g de açúcar) ou água açucarada (150 mL de água e 5g de açúcar) de acordo com a randomização dos braços, juntamente com um café da manhã padronizado composto por uma refeição sólida nutricionalmente equilibrada, isenta de (poli)fenóis e água (ad libitum).

Após o café da manhã, os participantes serão solicitados a coletar urina de forma autônoma nas próximas 48h em horários específicos (0 - 3h; 3 - 6h; 6 - 9h; 9 - 12h; 12 - 24h; 24 - 36h; e 36 - 48h), seguindo a mesma dieta personalizada. Por último, os sujeitos coletarão autonomamente uma amostra fecal dentro de 6 a 48 horas após a intervenção.

Na manhã do último dia, após a última coleta de urina, os sujeitos trarão amostras coletadas de urina e fezes e o diário alimentar de 5 dias para a Unidade de Nutrição Humana do Departamento de Alimentos e Medicamentos da Universidade de Parma.

Após o primeiro braço, os sujeitos retomarão seus estilos de vida habituais por 2 semanas consecutivas, posteriormente, farão outra consulta, quando serão repetidas todas as avaliações antropométricas realizadas na primeira visita e outro kit com alimentos e informações para a dieta personalizada será seja dado. Sendo o estudo um desenho cruzado, o protocolo seguido será o mesmo descrito acima (exceto para amostragem de saliva, que será realizada apenas uma vez). Chegando ao terceiro dia de dieta, os sujeitos que ingeriram café no braço anterior do estudo ingerirão água e vice-versa.

Para este estudo, o tamanho da amostra foi estimado considerando a concentração média de (poli)fenóis derivados do café e seus metabólitos na urina como desfecho primário e a literatura disponível sobre abordagens e estudos semelhantes na área. O número de 30 voluntários foi estabelecido considerando os parâmetros aceitos para ensaios clínicos (poder definido em 0,8 e α definido em 0,05), possíveis desistências (taxa de desistência de 15%) e exclusão de voluntários para manter o poder da amostra para análise estatística. Antes de qualquer comparação ser realizada, será avaliada a normalidade de cada variável para escolha do teste estatístico mais adequado. Se os dados do metabólito forem normalmente distribuídos, os dados serão expressos como média ± desvio padrão e analisados ​​usando teste t de medidas repetidas ou ANOVA com comparações post-hoc. Se os dados não forem normalmente distribuídos, eles serão relatados como mediana e intervalo interquartil e o teste de Friedman com comparações post hoc aos pares será realizado. Valor P <0,05 será considerado estatisticamente significativo.

Análises multivariadas não supervisionadas e supervisionadas serão utilizadas para identificar e caracterizar os diferentes metabótipos urinários, seguindo os procedimentos desenvolvidos pelo nosso grupo de pesquisa para análise metabolômica direcionada de metabólitos fenólicos ou quando usar dados metabolômicos não direcionados. Estaremos usando diferentes abordagens de cluster para explorar melhor a variabilidade existente. Isto servirá para estabelecer o número de clusters (isto é, metabótipos fenólicos), o número de participantes que formam cada cluster e as semelhanças entre os possíveis metabótipos.

A relação entre os padrões de LMWP e seus supostos determinantes (idade, sexo, etnia, estilo de vida, antropometria, composição corporal, genótipo e microbioma intestinal) será explorada por meio de testes de correlação e análises multivariadas. Valor P <0,05 será considerado estatisticamente significativo. As estatísticas serão realizadas pelo pessoal especializado da Unidade de Nutrição Humana, sob a supervisão do PI, e em colaboração com as equipas da Universidade responsáveis ​​pelo perfil microbiano e genotipagem.