Секвенирование микробиома всего кишечника у пациентов с нервной анорексией

ПРЕДПОСЫЛКИ Нервная анорексия (НА) представляет собой сложное расстройство, характеризующееся нарушением образа тела, эго-синтонным пренебрежением, амбивалентностью, самоголоданием, потерей массы тела, навязчивыми мыслями о еде, ритуальными схемами приема пищи, повышенной физической активностью, депрессией, тревогой. и эмоциональная ригидность. Доказательная база для лечения очень ограничена, учитывая степень, в которой это расстройство ухудшает качество жизни и по-прежнему имеет самый высокий уровень смертности среди всех психических заболеваний. Фактически, нет никаких доказательств того, что прогноз улучшился на протяжении 20 века.

АН остается синдромом, т.е. совокупностью симптомов, так как не определяется этиологией. Исследования близнецов последовательно демонстрировали, что анорексическая анорексия является строго семейной преимущественно из-за генетических факторов. Однако ни ген-кандидат, ни полногеномные исследования не выявили действительно подтвержденных генов для НА. АН связана с множественными глубокими эндокринными нарушениями. Однако до сих пор обширные исследования не привели к каким-либо прорывным открытиям. Необходимо новое мышление.

Колонизация кишечника человека начинается при рождении бактериями из влагалища матери и материнских фекалий, выделяемых при родах. У взрослых пищеварительный тракт человека содержит сложные наборы микроорганизмов, численность которых фактически превышает количество клеток-хозяев в 10:1. Эта кишечная микробиота и ее микробиом обеспечивают людей дополнительными генными продуктами, которые можно рассматривать как орган, который способствует множеству метаболических путей хозяина. Таким образом, производится целый ряд еще не идентифицированных веществ. Потенциально некоторые из этих веществ могут влиять на функции мозга, такие как регулирование аппетита и эмоций. Недавние достижения в технологиях секвенирования микробной ДНК привели к метагеномному анализу ДНК целых экосистем, таких как кишечник человека. Важный шаг вперед в изучении бактериального состава микробиома человека был сделан консорциумом «Метагеном кишечного тракта человека», сообщившим о первом полном атласе микробных генов дистального отдела кишечника человека с использованием глубокого секвенирования метагенома следующего поколения.

ЦЕЛЬ Исследовать, изменяется ли кишечная микробиота у пациентов с НА. В случае подтверждения это потенциально может играть роль в патогенезе, повышая предрасположенность к развитию и/или сохранению АН.

ГИПОТЕЗА Пациенты с НА имеют измененный состав кишечной микробиоты и функциональный потенциал, что определяется количественным метагеномным анализом микробной ДНК, выделенной из образцов стула и секвенированной с применением комбинации глубокого и нецелевого секвенирования дробовиком.

ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ Многоцентровое поперечное исследование, в котором профили кишечного микробиома у женщин с НА сравниваются со здоровыми женщинами того же возраста с нормальным весом.

ОБСУЖДЕНИЕ Пациенты охарактеризованы в соответствии с национальными рекомендациями. Следующие данные будут извлечены из медицинских файлов и включены в описательный и многомерный анализ.

Клинические переменные: возраст, продолжительность заболевания, ИМТ, % изменения веса за последние 4 недели, стационарное/амбулаторное лечение, медикаментозное лечение, сопутствующие соматические и психические заболевания, статус курения.

Психометрические переменные: Инвентаризация расстройств пищевого поведения (EDI)-3.

Контрольные субъекты: Контрольные субъекты будут подбираться, как описано, и распределяться среди братьев и сестер пациентов, местных медицинских работников или, при необходимости, из объявления на официальном датском веб-сайте для участия в клинических испытаниях. Женщины того же возраста заполняют анкету из 17 пунктов, связанных со здоровьем. Любое хроническое заболевание, прием лекарств или психическое заболевание в анамнезе приводят к их исключению из участия. Однако им разрешено использовать оральные контрацептивы.

ФЕКАЛЬНЫЕ ПРОБЫ Образцы фекалий собираются для того, чтобы охарактеризовать состав кишечного микробиома. Проба массой около 5 г отбирается с помощью поддона для сбора. Участников проинструктировали о немедленном хранении образца в морозильной камере при температуре -18°C. Транспортировка осуществляется при низких температурах в изолированном боксе, содержащем замороженные элементы, и передается исследовательскому персоналу максимум через 24 часа после доставки, где он хранится при -80°С до выделения ДНК.

УТРЕННЯЯ МОЧА НА ГОЛОДА Собирается 5 мл утренней мочи натощак.

АНАЛИЗ РАЗЛИЧИЙ В СОСТАВЕ ​​МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА Образцы фекалий обрабатываются и анализируются следующим образом: экстракция бактериальной ДНК, секвенирование ДНК дробовиком, анализ микробных генов, таксономический анализ, включая энтеротипы, известные виды и неизвестные метавиды (= количественная метагеномика), а также как аннотация функционального гена. Очистка ДНК и секвенирование методом дробовика выполняются в Unité MetaGenoPolis - Центре исследований Жуи-ан-Жоза, MGP-INRA, ЖУИ-ан-ЖОЗАС, ФРАНЦИЯ. Количественная метагеномика, как описано выше, выполняется подразделением биоинформатики и вычислительной метагеномики в CBMR с использованием установленных современных методологий.

БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ Основные параметры: Следующие анализы выполняются как неотъемлемая часть диагностики и лечения в специализированных отделениях и извлекаются из медицинских карт: Na, K, креатинин, карбамид, бикарбонат, Ca-ион, фосфат, гемоглобин, C -реактивный белок, лейкоциты, средний объем клеток, среднеклеточный концентрат гемоглобина, аланинаминотрансфераза, щелочная фосфатаза, билирубин, панкреатическая амилаза, Mg, Zn, тироксин, трийодтиронин, тиреотропин, кобаламин, фолиевая кислота, фолликулостимулирующий гормон, лютеинизирующий гормон, пролактин, эстрадиол , и витамин D. Значения будут скорректированы и выражены как отношение к нормальному значению на основе средних стандартных значений для каждого центра.

ОБРАЗЦЫ

Все образцы хранятся при -80 С:

• Фекалии 4 х 5 г.
• Сыворотка 20 х 500 мкл сыворотки.
• Плазма 20 х 500 мкл плазмы.
• Охристое пальто x 10.
• Утренняя моча 2 мл.

Биохимические анализы. Из образцов сыворотки/плазмы проводят следующие анализы: инсулин, инсулиноподобный фактор роста-I (IGF-I), IGF-1-связывающий белок-3, лептин и адипонектин.

БИОБАНК Образцы фекалий и вышеуказанные материалы будут храниться в биобанке до 30 лет. Если генотип микробиома для АН будет раскрыт, будут проведены дальнейшие геномные анализы, масс-спектроскопия метаболитов и, возможно, исследования прививок (с последующими новыми заявками в Комитет по этике).

СТАТИСТИКА Расчет мощности. Данные о микробиоте при НА отсутствуют. Количество участников основано на продолжающихся исследованиях кишечного микробиома у беременных женщин и пациентов с рассеянным склерозом, где размер популяции в 50 человек был оценен как подходящий для обеспечения мощности более 80% и значимости 5% для наблюдения различий в представить количественный метагеномный подход.

Многофакторный анализ. Статистические методы будут основываться на ранее разработанных методах и многомерных статистических подходах, применяемых в рамках консорциума «Метагеномика желудочно-кишечного тракта человека» (MetaHIT).

ЭТИКА Исследование одобрено и зарегистрировано в Региональном научном этическом комитете Южной Дании (номер файла 42053 S-20140040).

Участников спросят, готовы ли они сдать материал (фекалии, кровь, мочу) в биобанк для последующего анализа, и он будет использоваться только в соответствующих будущих исследованиях, для которых сначала будет получено одобрение от Научно-этического комитета. Образцы биобанка хранятся до 30 лет. Клинические, психометрические и биохимические параметры, упомянутые выше, извлекаются из медицинских файлов. Пациенты из трех участвующих центров получат приглашение на информационную встречу с одним из медицинских работников, который является одним из местных исследователей. Для субъектов моложе 18 лет (15-18 лет) один или оба родителя должны участвовать и должны предоставить письменное информированное согласие. Субъектам старше 18 лет разрешается привести друга или члена семьи в качестве наблюдателя. Следует подчеркнуть, что участие в нем является добровольным. Во время информационной встречи вручается официальный документ, опубликованный Национальным комитетом по этике исследований в области здравоохранения в 2012 году.

Приглашение братьев и сестер мотивировано тем фактом, что будущие исследования материала биобанка могут представлять особый интерес, если существует высокий уровень генетического родства между испытуемыми и контрольными субъектами. Однако включение пациента в настоящий проект не будет зависеть от наличия братьев и сестер, желающих участвовать.

Набор пациентов в возрасте до 15 лет мотивирован тем, что самая высокая распространенность НА приходится на эту возрастную группу. Чем старше пациент, тем выше вероятность наличия сопутствующей психической патологии. Поэтому для достоверности результатов будет важно, чтобы возрастной спектр также охватывал 15-18 лет.

ОБРАБОТКА И АРХИВИРОВАНИЕ ДАННЫХ Текущий протокол утвержден Датским агентством по защите данных (дело 1429534, 2008-58-035), и все документы и материалы, относящиеся к клиническому исследованию, будут храниться в соответствии с Законом об обработке персональных данных. Вся конфиденциальная информация личного, физического или биологического происхождения, относящаяся к отдельным участникам, будет рассматриваться конфиденциально в соответствии с законодательством Дании.

ФИНАНСЫ Это некоммерческое исследование, полностью независимое от коммерческих интересов. Будут поданы заявки на государственные и частные гранты для финансирования этого исследования.

ПЕРСПЕКТИВЫ Если настоящее исследование идентифицирует измененную кишечную флору при АН, оно послужит основой для нескольких важных новых исследований генных продуктов на лице и крови при АН, а также экспериментов по прививке гнотобиотическим мышам. Выяснение того, вовлечена ли кишечная флора в восприимчивость или поддержание АН, может послужить основой для разработки новых крайне необходимых методов лечения АН и, возможно, также ожирения.