Sequenzierung des gesamten Darmmikrobioms bei Patienten mit Anorexia Nervosa

HINTERGRUND Anorexia nervosa (AN) ist eine komplexe Störung, die durch gestörtes Körperbild, ich-syntonische Vernachlässigung, Ambivalenz, Selbsthunger, Gewichtsverlust, obsessive Gedanken an Essen, rituelle Muster der Nahrungsaufnahme, erhöhte körperliche Aktivität, Depression, Angst gekennzeichnet ist und emotionale Starrheit. Die Evidenzbasis für die Behandlung ist sehr begrenzt, wenn man bedenkt, in welchem ​​Ausmaß diese Störung die Lebensqualität beeinträchtigt und immer noch die höchste Sterblichkeitsrate aller psychiatrischen Erkrankungen aufweist. Tatsächlich gibt es keine Hinweise darauf, dass sich die Prognose im Laufe des 20. Jahrhunderts verbessert hat.

AN bleibt ein Syndrom, d. h. eine Ansammlung von Symptomen, da sie nicht durch die Ätiologie definiert ist. Zwillingsstudien haben durchweg gezeigt, dass AN hauptsächlich aufgrund genetischer Faktoren stark familiär ist. Allerdings haben weder Kandidatengen noch genomweite Studien wirklich validierte Gene für AN identifiziert. AN ist mit multiplen, tiefgreifenden endokrinen Störungen verbunden. Bisher hat die umfangreiche Forschung jedoch zu keiner bahnbrechenden Entdeckung geführt. Es braucht neues Denken.

Die Besiedelung des menschlichen Darms beginnt bei der Geburt mit Bakterien aus der Vagina der Mutter und durch die Arbeit freigesetzten mütterlichen Fäkalien. Bei Erwachsenen enthält der menschliche Verdauungstrakt komplexe Ansammlungen von Mikroorganismen, die die Zahl der Wirtszellen tatsächlich um 10:1 übersteigen. Diese Darmmikrobiota und ihr Mikrobiom versorgen den Menschen mit zusätzlichen Genprodukten, die als Organ angesehen werden können, das zu mehreren Stoffwechselwegen des Wirts beiträgt. So entsteht eine ganze Reihe von Stoffen, die noch nicht identifiziert sind. Möglicherweise können einige dieser Substanzen Funktionen im Gehirn beeinflussen, wie z. B. Appetit- und Emotionsregulation. Jüngste Fortschritte bei mikrobiellen DNA-Sequenzierungstechnologien haben zur metagenomischen DNA-Analyse ganzer Ökosysteme wie des menschlichen Darms geführt. Ein wichtiger Schritt vorwärts bei der Untersuchung der bakteriellen Zusammensetzung des menschlichen Mikrobioms wurde mit dem Metagenome of the Human Intestinal Tract Consortium gemacht, das den ersten vollständigen mikrobiellen Genatlas des menschlichen distalen Darms unter Verwendung von Metagenom-Tiefensequenzierung der nächsten Generation vorstellte.

ZIEL Untersuchung, ob die Darmmikrobiota bei Patienten mit AN verändert ist. Wenn dies bestätigt wird, kann dies möglicherweise eine Rolle bei der Pathogenese spielen und die Anfälligkeit für die Entwicklung und/oder Aufrechterhaltung von AN fördern.

HYPOTHESE Patienten mit AN weisen eine veränderte Zusammensetzung der Darmmikrobiota und ein verändertes funktionelles Potenzial auf, wie durch quantitative metagenomische Analysen von mikrobieller DNA bestimmt wurde, die aus Stuhlproben isoliert und unter Anwendung einer Kombination aus tiefer und ungezielter Shotgun-Sequenzierung sequenziert wurde.

STUDIENDESIGN Eine multizentrische Querschnittsstudie, in der die Profile des Darmmikrobioms bei Frauen mit AN mit altersangepassten gesunden, normalgewichtigen Frauen verglichen werden.

PROJEKTE Die Patienten werden gemäß den nationalen Leitlinien charakterisiert. Die folgenden Daten werden aus den Krankenakten extrahiert und in die deskriptiven und multivariaten Analysen einbezogen.

Klinische Variablen: Alter, Krankheitsdauer, BMI, Gewichtsveränderung in % in den letzten 4 Wochen, In-/Out-Patientenstatus, Medikation, somatische und psychiatrische Komorbidität, Raucherstatus.

Psychometrische Variablen: Eating Disorder Inventory (EDI)-3.

Kontrollpersonen: Die Kontrollpersonen werden wie beschrieben abgeglichen und von Geschwistern der Patienten, lokalen Gesundheitspersonal oder, falls erforderlich, von der Ankündigung auf einer offiziellen dänischen Website zur Teilnahme an klinischen Studien zugewiesen. Die gleichaltrigen Frauen füllen einen 17-Punkte-Fragebogen zur Gesundheit aus. Chronische Erkrankungen, Medikamente oder psychiatrische Vorerkrankungen führen zum Ausschluss von der Teilnahme. Sie dürfen jedoch orale Kontrazeptiva verwenden.

Kotprobenahme Kotproben werden gesammelt, um die Zusammensetzung des Darmmikrobioms zu charakterisieren. Mit Hilfe einer Auffangschale wird eine Probe von ca. 5 g gesammelt. Die Teilnehmer werden angewiesen, die Probe sofort in ihrem Gefrierschrank bei -18 °C zu lagern. Der Transport erfolgt bei kalten Temperaturen in einer isolierten Kiste mit gefrorenen Elementen und wird maximal 24 Stunden nach der Lieferung an das Studienpersonal übergeben, wo es bis zur DNA-Extraktion bei -80 C gelagert wird.

Nüchternmorgenurin Es werden 5 ml morgendlicher Nüchternurin gesammelt.

ANALYSE AUF UNTERSCHIEDE IN DER DARMMIKROBIOTA-ZUSAMMENSETZUNG Die Kotproben werden wie folgt verarbeitet und analysiert: Bakterien-DNA-Extraktion, Shotgun-Illumine-DNA-Sequenzierung, mikrobielle Genanalysen, Taxonomieanalysen einschließlich Entero-Typen, bekannter Arten und unbekannter Meta-Spezies (=quantitative Metagenomik). als funktionelle Genannotation. Die DNA-Reinigung und die Shotgun-Sequenzierung werden in der Unité MetaGenoPolis – Centre de recherche de Jouy-en-Josas, MGP-INRA, JOUY en JOSAS, FRANKREICH – durchgeführt. Die oben beschriebene quantitative Metagenomik wird von der Abteilung für Bioinformatik und rechnergestützte Metagenomik am CBMR unter Anwendung etablierter, hochmoderner Methoden durchgeführt.

BIOCHEMISCHE VARIABLEN Basisparameter: Folgende Analysen werden als integraler Bestandteil der Diagnostik und Behandlung in spezialisierten Einheiten durchgeführt und aus den Krankenakten extrahiert: Na, K, Kreatinin, Carbamid, Bicarbonat, Ca-Ionen, Phosphat, Hämoglobin, C -reaktives Protein, Leukozyten, mittleres Zellvolumen, mittleres Zellhämoglobinkonzentrat, Alanin-Aminotransferase, alkalische Phosphatase, Bilirubin, Pankreas-Amylase, Mg, Zn, Thyroxin, Trijodthyronin, Thyrotropin, Cobalamin, Folsäure, follikelstimulierendes Hormon, luteinisierendes Hormon, Prolaktin, Estradiol und Vitamin D. Die Werte werden angepasst und als Verhältnis zum Normalwert auf der Grundlage der durchschnittlichen Standardwerte für jedes Zentrum ausgedrückt.

PROBEN

Alle Proben werden bei -80 C gelagert:

• Kot 4 x 5 g.
• Serum 20 x 500 Mikroliter Serum.
• Plasma 20 x 500 Mikroliter Plasma.
• Buffy-Coat x 10.
• Morgenurin 2 ml.

Biochemische Analysen: Aus dem entnommenen Serum/Plasma werden folgende Analysen durchgeführt: Insulin, insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I (IGF-I), IGF-1-Bindungsprotein-3, Leptin und Adiponektin.

BIOBANK Die Kotproben und die oben genannten Materialien werden bis zu 30 Jahre in einer Biobank aufbewahrt. Wenn ein Mikrobiom-Genotyp für AN offengelegt wird, werden weitere genomische Analysen, Massenspektroskopie für Metaboliten und möglicherweise Impfstudien durchgeführt (gefolgt von neuen Anträgen bei der Ethikkommission).

STATISTIK Leistungsberechnung. Es liegen keine Daten zur Mikrobiota in AN vor. Die Anzahl der Teilnehmer basiert auf laufenden Studien zum Darmmikrobiom bei Schwangeren und Patienten mit Multipler Sklerose, bei denen eine Populationsgröße von 50 als angemessen eingeschätzt wurde, um eine Aussagekraft von mehr als 80 % und eine Signifikanz von 5 % für die Beobachtung von Unterschieden zu erzielen präsentieren einen quantitativen Metagenomik-Ansatz.

Multivariate Analyse. Statistische Methoden bauen auf zuvor entwickelten Methoden und multivariaten statistischen Ansätzen auf, die im Konsortium Metagenomics of the Human Intestinal Tract (MetaHIT) angewendet werden.

ETHIK Die Studie ist bei der regionalen wissenschaftlichen Ethikkommission für Süddänemark genehmigt und registriert (Aktenzeichen 42053 S-20140040).

Die Teilnehmer werden gefragt, ob sie bereit sind, das Material (Kot, Blut, Urin) zur späteren Analyse an eine Biobank zu spenden, und es wird nur in verwandten zukünftigen Studien verwendet, für die zuerst die Genehmigung der Wissenschaftlichen Ethikkommission eingeholt wird. Die Proben der Biobank werden bis zu 30 Jahre aufbewahrt. Die oben erwähnten klinischen, psychometrischen und biochemischen Variablen werden aus Krankenakten extrahiert. Patienten aus den drei teilnehmenden Zentren erhalten eine Einladung zu einem Informationstreffen mit einem der Gesundheitshelfer, der einer der lokalen Prüfärzte ist. Bei Probanden unter 18 Jahren (15 - 18 Jahre) müssen ein oder beide Elternteile teilnehmen und eine schriftliche Einverständniserklärung abgeben. Probanden über 18 Jahren dürfen einen Freund oder ein Familienmitglied als Beobachter mitbringen. Es wird betont, dass die Teilnahme freiwillig ist. Während des Informationstreffens wird ein offizielles Dokument des National Committee on Health Research Ethics 2012 übergeben.

Die Einladung von Geschwistern ist dadurch motiviert, dass zukünftige Untersuchungen von Biobankmaterial von besonderem Interesse sein können, wenn eine hohe genetische Verwandtschaft zwischen den Testpatienten und den Kontrollpersonen besteht. Der Patienteneinschluss in das vorliegende Projekt wird jedoch nicht davon abhängen, ob es Geschwister gibt, die teilnehmen möchten.

Die Rekrutierung von Patienten bis zum 15. Lebensjahr ist durch die Tatsache motiviert, dass in dieser Altersgruppe die höchste AN-Prävalenz vorliegt. Je älter der Patient, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit einer psychiatrischen Komorbidität. Für die Aussagekraft der Ergebnisse wird es daher wichtig sein, dass das Altersspektrum auch 15 - 18 Jahre umfasst.

HANDHABUNG UND ARCHIVIERUNG VON DATEN Das aktuelle Protokoll ist von der dänischen Datenschutzbehörde genehmigt (Fallakten 1429534, 2008-58-035) und alle Dokumente und Materialien im Zusammenhang mit der klinischen Studie werden gemäß dem Gesetz über die Verarbeitung personenbezogener Daten gespeichert. Alle sensiblen Informationen persönlicher, physischer oder biologischer Herkunft in Bezug auf die einzelnen Teilnehmer werden gemäß der dänischen Gesetzgebung vertraulich behandelt.

FINANZEN Dies ist eine Non-Profit-Studie, völlig unabhängig von kommerziellen Interessen. Zur Finanzierung dieser Studie werden öffentliche und private Zuschüsse beantragt.

PERSPEKTIVEN Wenn die vorliegende Studie eine veränderte Darmflora bei AN identifiziert, liefert sie die Grundlage für mehrere wichtige neue Studien zu Genprodukten in Gesichtern und Blut bei AN sowie für Inokulationsexperimente mit gnotobiotischen Mäusen. Die Klärung, ob die Darmflora an der Anfälligkeit oder Aufrechterhaltung von AN beteiligt ist, kann die Grundlage für die Entwicklung neuer, dringend benötigter Behandlungen von AN und möglicherweise auch von Fettleibigkeit bilden.