Precisionsdiagnostik vid sällsynta genetiska sjukdomar och tumörer - Långläst sekvensering (PREDICT-LRS)

Nyligen introducerad långläsningssekvensering (LR), även kallad tredje generationens sekvensering, är en revolutionerande teknik med förmågan att sekvensera långa molekyler av nukleinsyror (längre än 10 kB). Tillgången till längre exakta sekvenser har förbättrat kartläggbarhet och övervann de tekniska begränsningarna för NGS. Tillämpningen av LR på en diagnostisk inställning kan påverka detekteringsgraden och diagnostiskt utbyte, vilket kan leda till en bättre förståelse av etiologi, prognos och återfallsrisk för RGD, men också på en riktad behandling. En av de viktigaste fördelarna med LRS är detektering av balanserade och obalanserade strukturella varianter (SV), inklusive komplexa omarrangemang, med hög känslighet och noggrannhet, genom tillförlitlig justering och exakt brytpunktsdefinition. Olika studier har också rapporterat dess användbarhet vid identifiering av missade kodningsvarianter i svåra att sekvensregioner. Dessutom ger denna metod tillgång till information om metyleringsförändringar och fasning av haplotyp i ett enda experiment.

Bland de viktigaste utmaningarna med modern genetik identifieras 4 undergrupper av patienter som skulle dra nytta av tillämpningen av LR: er för att bättre karakterisera den genetiska diagnosen och sjukdomsmekanismerna.

• Den första undergruppen av patienter är de med SV: er av okänd betydelse eller osäker sjukdomsmekanism. De mest diagnostiskt undersökta SV: erna, främst hos individer med NDD, är kopieringsnummervarianter (CNV), dvs. deletioner och duplikationer, och det första nivå genetiska testet för deras identifiering är matrisbaserad jämförande genomisk hybridisering (ACGH). Denna analys har ett diagnostiskt utbyte på cirka 10-20% på vilka vissa tekniska begränsningar negativt påverkar: dålig känslighet för mosaik CNV: er eller varianter belägna i genomiska regioner som är svåra att analysera (GC-rika eller upprepade), suboptimal upplösning för brytning av CNV: er och oförmåga att kartlägga duplikationer. I synnerhet är klinisk tolkning av duplikationer utmanande, på grund av oförmågan hos ACGH att upptäcka om de förekommer i tandem eller dupliceras och sätts in någon annanstans i genomet, vilket möjligen störande gener involverade i dupliceringen eller förändrar deras reglering. LRS har potential att övervinna dessa begränsningar genom att ha betydligt större känslighet för detektering av SV: er, inklusive CNV: er och av varianter inom upprepade regioner, vilket också möjliggör kartläggning av duplikationer och exakt chacterisering av brekpoints.
• Andra komplexa omarrangemang kan studeras med LR (dvs. Ringkromosomer, isokromosom, kromosomala translokationer, somatisk SV som finns i tumörer, etc.) för att få en bättre förståelse för molekylmekanismerna för patogenicitet. I dessa fall krävs den exakta definitionen av brytpunkter, av generna som är involverade i omarrangemanget, av metyleringstillståndet och detekteringen av både balanserade och obalanserade SV: er för att förstå den molekylära defekten som är ansvarig för sjukdomen. En bättre definition av komplexa SV: er, tillsammans med en exakt beskrivning av fenotypen, gör det möjligt att bestämma genotypfenotypen.
• En tredje undergrupp av patienter som är berättigade till studien är de med identifierad monoallell förändring i autosomala recessiva (AR) gener. För detta ändamål är utvalda patienter med RGD där omfattande genetisk analys, dvs hela exome -sekvensering (WES), redan har utförts, vilket leder till identifiering av en monoallell mutation i en gen associerad med ett AR -tillstånd som är kompatibelt med patienten fenotyp. Syftet är att utföra en riktad analys av den specifika genen för att leta efter en andra mutation som inte upptäcktes genom tidigare analys (dvs. Introniska varianter, SV: er, varianter i svåra genomiska regioner).
• Slutligen kan patienter med en fenotyp som är starkt tyder på ett genetiskt tillstånd, i vilka flera analyser, inklusive WES, hämtade negativa resultat, dra nytta av LR. I detta sammanhang är syftet att tillämpa en hel genom-LRS-strategi för att identifiera missade kodningsvarianter i svåra till sekvensregioner, varianter i icke-kodande regioner eller SV.