Diagnóstico de precisión en enfermedades genéticas raras y tumores: secuenciación de lectura larga (PREDICT-LRS)

Recientemente introducida secuenciación de lectura larga (LRS), también conocida como secuenciación de tercera generación, es una tecnología revolucionaria con la capacidad de secuenciar moléculas largas de ácidos nucleicos (más de 10 kb). El acceso a secuencias precisas más largas ha mejorado la map se ha mejorado y ha superado las limitaciones técnicas de NGS. La aplicación de LRS a un entorno diagnóstico podría tener un impacto en la tasa de detección y el rendimiento de diagnóstico, lo que lleva a una mejor comprensión de la etiología, el pronóstico y el riesgo de recurrencia de RGD, pero también a un tratamiento dirigido. Uno de los principales beneficios de LRS es la detección de variantes estructurales equilibradas y desequilibradas (SVS), incluidos reordenamientos complejos, con alta sensibilidad y precisión, a través de una alineación confiable y una definición precisa de punto de ruptura. Varios estudios también han informado su utilidad en la identificación de variantes de codificación perdidas en regiones difíciles de secuencia. Además, este método brinda acceso a información sobre los cambios de metilación y la fase de haplotipo en un solo experimento.

Entre los principales desafíos de la genética moderna, se identifican 4 subgrupos de pacientes que se beneficiarían de la aplicación de LRS para caracterizar mejor el diagnóstico genético y los mecanismos de enfermedades.

• El primer subgrupo de pacientes son aquellos con SV de importancia desconocida o mecanismo de enfermedad incierta. Los SV más investigados diagnósticos, principalmente en individuos con NDD, son las variantes de número de copias (CNV), es decir, deleciones y duplicaciones, y la prueba genética de primer nivel para su identificación es la hybridación genómica comparativa basada en la matriz (ACGH). Este análisis tiene un rendimiento de diagnóstico de aproximadamente 10-20% en el que algunas limitaciones técnicas impactan negativamente: mala sensibilidad para los CNV o variantes de mosaico ubicados en regiones genómicas que son difíciles de analizar (ricas en GC o repetidas), resolución subóptima para el punto de interrupción de los CNV de CNVS e incapacidad para mapear duplicaciones. En particular, la interpretación clínica de las duplicaciones es un desafío, debido a la incapacidad de ACGH para detectar si ocurren en tándem o se duplican e insertan en otras partes del genoma, posiblemente interrumpiendo los genes involucrados en la duplicación o alterando su regulación. LRS tiene el potencial de superar estas limitaciones al tener una sensibilidad significativamente mayor para la detección de SV, incluidos los CNV, y de variantes dentro de las regiones repetidas, lo que también permite el mapeo de duplicaciones y la chacterización precisa de los puntos brekos.
• Se pueden estudiar otros reordenamientos complejos con LRS (es decir, cromosomas de anillo, isocromosomas, translocaciones cromosómicas, SV somático que se encuentra en tumores, etc.) para obtener una mejor comprensión de los mecanismos moleculares de la patogenicidad. En estos casos, la definición precisa de los puntos de interrupción, de los genes involucrados en el reordenamiento, del estado de metilación y la detección de SVS equilibrados y desequilibrados es necesaria para comprender el defecto molecular responsable de la enfermedad. Una mejor definición de SVS complejo, junto con una descripción precisa del fenotipo, permitirá que se determine la correlación del genotipo-fenotipo.
• Un tercer subgrupo de pacientes elegibles para el estudio son aquellos con alteración monoalélica identificada en genes autosómicos recesivos (AR). Para este propósito, se seleccionan pacientes con RGD en los que ya se ha realizado un análisis genético extenso, es decir, la secuenciación de exoma completo (WES), lo que lleva a la identificación de una mutación monoalélica en un gen asociado con una condición AR que es compatible con el paciente fenotipo. El objetivo es realizar un análisis específico del gen específico para buscar una segunda mutación que no se detectara mediante análisis previo (es decir, Variantes intrónicas, SVS, variantes en regiones genómicas difíciles).
• Por último, los pacientes con un fenotipo que es muy sugerente para una condición genética, en la que varios análisis, incluidos WE, recuperaron resultados negativos, podrían beneficiarse de LRS. En este contexto, el objetivo es aplicar un enfoque LRS de genoma completo para identificar variantes de codificación perdidas en regiones difíciles de secuencia, variantes en regiones no codificantes o SVS.