Diagnóstico de precisão em doenças genéticas raras e tumores - sequenciamento de leitura longa (PREDICT-LRS)

Recentemente introduzido sequenciamento de leitura longa (LRS), também conhecida como sequenciamento de terceira geração, é uma tecnologia revolucionária com a capacidade de sequenciar moléculas longas de ácidos nucleicos (mais de 10kb). O acesso a sequências mais precisas melhorou a mapena e superou as limitações técnicas do NGS. A aplicação de LRS a um cenário de diagnóstico pode ter um impacto na taxa de detecção e no rendimento diagnóstico, levando a uma melhor compreensão da etiologia, prognóstico e risco de recorrência de RGD, mas também a um tratamento direcionado. Um dos principais benefícios do LRS é a detecção de variantes estruturais equilibradas e desequilibradas (SVs), incluindo rearranjos complexos, com alta sensibilidade e precisão, por meio de alinhamento confiável e definição precisa do ponto de interrupção. Vários estudos também relataram sua utilidade na identificação de variantes de codificação perdidas em regiões de difícil sequência. Além disso, esse método fornece acesso a informações sobre alterações de metilação e fase de haplótipo em um único experimento.

Entre os principais desafios da genética moderna, estão identificados 4 subgrupos de pacientes que se beneficiariam da aplicação de LRS para caracterizar melhor o diagnóstico genético e os mecanismos de doença.

• O primeiro subgrupo de pacientes são aqueles com SVs de significado desconhecido ou mecanismo de doença incerta. Os SVs mais investigados no diagnóstico, principalmente em indivíduos com NDD, são variantes de número de cópias (CNVs), isto é, deleções e duplicações, e o teste genético de primeiro nível para sua identificação é a hibridação genômica comparativa baseada em matriz (ACGH). Esta análise tem um rendimento diagnóstico de cerca de 10 a 20%, nas quais algumas limitações técnicas impactam negativamente: baixa sensibilidade para CNVs ou variantes em mosaico localizadas em regiões genômicas difíceis de analisar (rica em GC ou repetidas), resolução abaixo do ideal para ponto de interrupção de CNVs e incapacidade de mapear duplicações. Em particular, a interpretação clínica das duplicações é desafiadora, devido à incapacidade do ACGH de detectar se elas ocorrem em conjunto ou são duplicadas e inseridas em outras partes do genoma, possivelmente interrompendo os genes envolvidos na duplicação ou alterando sua regulamentação. O LRS tem o potencial de superar essas limitações, tendo sensibilidade significativamente maior para a detecção de SVs, incluindo os CNVs e de variantes em regiões repetidas, também permitindo mapeamento de duplicações e escacteração precisa dos pontos de brekpoint.
• Outros rearranjos complexos podem ser estudados com LRS (ou seja, Cromossomos anel, isocromossomo, translocações cromossômicas, SV somático encontrado em tumores etc.) para obter uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares de patogenicidade. Nesses casos, é necessária a definição precisa de pontos de interrupção, dos genes envolvidos no rearranjo, no estado de metilação e na detecção de SVs equilibrados e desequilibrados para entender o defeito molecular responsável pela doença. Uma melhor definição de SVs complexos, juntamente com uma descrição precisa do fenótipo, permitirá que a correlação do genótipo-fenótipo seja determinada.
• Um terceiro subgrupo de pacientes elegíveis para o estudo são aqueles com alteração monoalétrica identificada em genes autossômicos recessivos (AR). Para esse fim, são pacientes selecionados com RGD nos quais já foi realizada uma extensa análise genética, isto é, sequenciamento de todo o exoma (WES), levando à identificação de uma mutação monoiletral em um gene associado a uma condição de AR que é compatível com o paciente do paciente fenótipo. O objetivo é realizar uma análise direcionada do gene específico para procurar uma segunda mutação que não foi detectada por análises anteriores (ou seja, variantes intrônicas, SVs, variantes em regiões genômicas difíceis).
• Por fim, pacientes com um fenótipo que é fortemente sugestivo para uma condição genética, na qual várias análises, incluindo WES, recuperadas, resultados negativos, poderiam se beneficiar do LRS. Nesse contexto, o objetivo é aplicar toda uma abordagem LRS do genoma para identificar variantes de codificação perdidas em regiões de difícil sequência, variantes em regiões ou SVs não codificantes.