Precyzyjna diagnostyka w rzadkich chorobach genetycznych i guzach - długie sekwencjonowanie (PREDICT-LRS)

Niedawno wprowadzone długie sekwencjonowanie odczytu (LRS), określane również jako sekwencjonowanie trzeciej generacji, jest rewolucyjną technologią o zdolności do sekwencjonowania długich cząsteczek kwasów nukleinowych (dłuższe niż 10 kb). Dostęp do dłuższych dokładnych sekwencji poprawił mapowanie i pokonał ograniczenia techniczne NGS. Zastosowanie LRS do ustawienia diagnostycznego może mieć wpływ na szybkość wykrywania i wydajność diagnostyczną, co prowadzi do lepszego zrozumienia etiologii, prognozowania i ryzyka nawrotu RGD, ale także do ukierunkowanego leczenia. Jedną z głównych zalet LR jest wykrywanie zrównoważonych i niezrównoważonych wariantów strukturalnych (SVS), w tym złożone przegrupowania, o wysokiej czułości i dokładności, poprzez wiarygodne wyrównanie i precyzyjną definicję punktu przerwania. Różne badania zgłosiły również swoją użyteczność w identyfikacji pominiętych wariantów kodowania w regionach trudnych w sekwencji. Ponadto ta metoda daje dostęp do informacji o zmianach metylacji i fazie haplotypów w jednym eksperymencie.

Wśród głównych wyzwań współczesnej genetyki zidentyfikowano 4 podgrupy pacjentów, które skorzystałyby z zastosowania LRS w celu lepszego scharakteryzowania diagnozy genetycznej i mechanizmów choroby.

• Pierwsza podgrupa pacjentów to osoby z SV o nieznanym znaczeniu lub niepewnym mechanizmie choroby. Najbardziej badane diagnostycznie SV, głównie u osób z NDD, są warianty liczb kopii (CNV), tj. Usunięcia i duplikacje oraz test genetyczny pierwszego poziomu do ich identyfikacji jest porównawcza hybrydyzacja genomowa oparta na tablicy (ACGH). Ta analiza ma wydajność diagnostyczną wynoszącą około 10-20%, na której pewne ograniczenia techniczne negatywnie wpływają: słabą wrażliwość na mozaiki CNV lub warianty znajdujące się w regionach genomowych, które są trudne do analizy (bogate w GC lub powtarzane), nieoptymalna rozdzielczość dla przerwania CNVS i niezdolność do mapowania duplikacji. W szczególności kliniczna interpretacja duplikacji jest trudna ze względu na niezdolność ACGH do wykrycia, czy występują one w tandemie, czy są powielane i wstawiane w innym miejscu genomu, prawdopodobnie zakłócając geny zaangażowane w powielanie lub zmianę ich regulacji. LRS może przezwyciężyć te ograniczenia, mając znacznie większą wrażliwość na wykrywanie SV, w tym CNV, oraz wariantów w powtarzanych regionach, umożliwiając również mapowanie duplikacji i precyzyjną nakrapianie punktów brekpoint.
• Inne złożone przegrupowania można badać za pomocą LRS (tj. Chromosomy pierścieniowe, izochromosom, translokacje chromosomalne, somatyczne SV znalezione w guzach itp.), Aby lepiej zrozumieć molekularne mechanizmy patogenności. W takich przypadkach potrzebna jest precyzyjna definicja punktów przerwania, genów zaangażowanych w rearangecję, stanu metylacji oraz wykrywanie zarówno zrównoważonych, jak i niezrównoważonych SVS, aby zrozumieć wadę molekularną odpowiedzialną za chorobę. Lepsza definicja złożonych SVS wraz z dokładnym opisem fenotypu pozwoli na określenie korelacji genotyp-fenotyp.
• Trzecią podgrupą pacjentów kwalifikujących się do badania są pacjenci o zidentyfikowanej zmianie mono -równoległej w genach recesywnych autosomalnych (AR). W tym celu są wybrani pacjenci z RGD, w których przeprowadzono już obszerną analizę genetyczną, tj. Sekwencjonowanie całego egzomu (WES), co prowadzi do identyfikacji mutacji mono -równoległej w genie związanym z warunkiem AR, który jest kompatybilny z pacjentem fenotyp. Celem jest przeprowadzenie ukierunkowanej analizy konkretnego genu w celu poszukiwania drugiej mutacji, która nie została wykryta przez poprzednią analizę (tj. Warianty intronowe, SV, warianty w trudnych regionach genomowych).
• Wreszcie, pacjenci z fenotypem, który jest silnie sugerujący dla stanu genetycznego, w którym kilka analiz, w tym WES, odzyskały negatywne wyniki, mogli skorzystać z LRS. W tym kontekście celem jest zastosowanie podejścia całego genomu LRS w celu identyfikacji pominiętych wariantów kodowania w obszarach trudnych w sekwencji, wariantach w regionach niekodujących lub SVS.