Presisjonsdiagnostikk ved sjeldne genetiske sykdommer og svulster - Langlest sekvensering (PREDICT-LRS)

Nylig introdusert Long Read Sequencing (LRS), også referert til som tredje generasjons sekvensering, er en revolusjonerende teknologi med evnen til å sekvensere lange molekyler av nukleinsyrer (lengre enn 10 kb). Tilgangen til lengre nøyaktige sekvenser har forbedret mappabilitet og overvunnet de tekniske begrensningene til NGS. Anvendelsen av LRS på en diagnostisk innstilling kan ha innvirkning på deteksjonshastighet og diagnostisk utbytte, noe som fører til en bedre forståelse av etiologien, prognosen og tilbakefallsrisikoen for RGD, men også på en målrettet behandling. En av de viktigste fordelene med LR -er er påvisning av balanserte og ubalanserte strukturelle varianter (SV), inkludert komplekse omorganiseringer, med høy følsomhet og nøyaktighet, gjennom pålitelig innretting og presis definisjon av breakpoint. Ulike studier har også rapportert dens nytteverdi i identifiseringen av tapte kodingsvarianter i vanskelige-til-sekvensregioner. Videre gir denne metoden tilgang til informasjon om metyleringsendringer og haplotypefasing i et enkelt eksperiment.

Blant de viktigste utfordringene med moderne genetikk, identifiseres 4 undergrupper av pasienter som vil dra nytte av anvendelsen av LR for bedre å karakterisere den genetiske diagnose og sykdomsmekanismer.

• Den første undergruppen av pasienter er de med SV -er av ukjent betydning eller usikker sykdomsmekanisme. Den mest diagnostisk undersøkte SV-ene, hovedsakelig hos individer med NDD, er kopienummervarianter (CNV), dvs. slettinger og duplikasjoner, og den første nivået av genetisk test for deres identifikasjon er array-basert komparativ genomisk hybridisering (ACGH). Denne analysen har en diagnostisk utbytte på omtrent 10-20% som noen tekniske begrensninger påvirker negativt: dårlig følsomhet for mosaikk-CNV-er eller varianter lokalisert i genomiske regioner som er vanskelige å analysere (GC-rik eller gjentatt), suboptimal oppløsning for bruddpunkt av CNVS og manglende evne til å kartlegge duplikasjoner. Spesielt er klinisk tolkning av duplikasjoner utfordrende, på grunn av ACGH -manglende evne til å oppdage om de oppstår i tandem eller dupliseres og settes inn andre steder i genomet, og dermed muligens forstyrrer gener som er involvert i dupliseringen eller endrer deres regulering. LRS har potensial til å overvinne disse begrensningene ved å ha betydelig større følsomhet for påvisning av SV -er, inkludert CNV -er, og av varianter i gjentatte regioner, og muliggjør også kartlegging av duplikasjoner og presis kakterisering av Brekpoints.
• Andre komplekse omorganiseringer kan studeres med LRs (dvs. Ringkromosomer, isokromosom, kromosomale translokasjoner, somatisk SV funnet i svulster, etc.) for å få en bedre forståelse av molekylære mekanismer for patogenisitet. I disse tilfellene er den nøyaktige definisjonen av bruddpunkter, av genene som er involvert i omorganiseringen, av metyleringstilstanden og påvisning av både balanserte og ubalanserte SV -er, nødvendig for å forstå den molekylære defekten som er ansvarlig for sykdommen. En bedre definisjon av komplekse SV-er, sammen med en nøyaktig beskrivelse av fenotypen, vil tillate at genotype-fenotypekorrelasjonen bestemmes.
• En tredje undergruppe av pasienter som er kvalifisert for studien er de med identifisert monoallell endring i autosomale recessive (AR) gener. For dette formålet er utvalgte pasienter med RGD der omfattende genetisk analyse, dvs. hele eksomsekvensering (WES), allerede er utført, noe som fører til identifisering av en monoallell mutasjon i et gen assosiert med en AR -tilstand som er kompatibel med pasientens fenotype. Målet er å utføre en målrettet analyse av det spesifikke genet for å se etter en andre mutasjon som ikke ble påvist ved tidligere analyse (dvs. Introniske varianter, SV -er, varianter i vanskelige genomiske regioner).
• Til slutt kan pasienter med en fenotype som er sterkt suggererende for en genetisk tilstand, der flere analyser, inkludert WES, hentet negative resultater, dra nytte av LR -er. I denne sammenhengen er målet å anvende en hel genom LRS-tilnærming for å identifisere tapte kodingsvarianter i vanskelige-til-sekvensregioner, varianter i ikke-kodende regioner eller SV-er.