Přesná diagnostika u vzácných genetických onemocnění a nádorů - dlouhé čtení sekvenování (PREDICT-LRS)

Nedávno zavedeno dlouhé čtení sekvenování (LRS), také označované jako sekvenování třetí generace, je revoluční technologie se schopností sekvenovat dlouhé molekuly nukleových kyselin (delší než 10 kB). Přístup k delších přesných sekvencích má zlepšenou schopnost a překonává technická omezení NGS. Aplikace LRS na diagnostické nastavení by mohlo mít dopad na míru detekce a diagnostický výnos, což by vedlo k lepšímu pochopení etiologie, prognózy a rizika recidivy RGD, ale také na cílenou léčbu. Jednou z hlavních výhod LR je detekce vyvážených a nevyvážených strukturálních variant (SVS), včetně složitých přeskupení, s vysokou citlivostí a přesností, prostřednictvím spolehlivého zarovnání a přesné definice bodu zlomu. Různé studie také uváděly jeho užitečnost při identifikaci zmeškaných variant kódování v regionech obtížně sekvencí. Tato metoda navíc poskytuje přístup k informacím o změnách methylace a fázování haplotypů v jednom experimentu.

Mezi hlavní výzvy moderní genetiky jsou identifikovány 4 podskupiny pacientů, které by prospěly z použití LRS pro lepší charakterizaci genetické diagnózy a mechanismů onemocnění.

• První podskupinou pacientů jsou ti s SV s neznámým významem nebo nejistým mechanismem onemocnění. Nejvíce diagnosticky zkoumané SVS, zejména u jedinců s NDD, jsou varianty počtu kopií (CNV), tj. Delece a duplikace a první genetický test na jejich identifikaci je srovnávací genomická hybridizace založená na poli (ACGH). Tato analýza má diagnostický výnos ve výši asi 10-20%, na které některá technická omezení negativně ovlivňuje: špatná citlivost na mozaiku CNV nebo varianty umístěné v genomických oblastech, které je obtížné analyzovat (GC bohaté nebo opakované), suboptimální rozlišení CNVS a neschopnost mapovat duplikace. Zejména je klinická interpretace duplikací náročná kvůli neschopnosti ACGH detekovat, zda k nim dochází v tandemu nebo jsou duplikovány a vloženy jinde v genomu, což možná narušuje geny zapojené do duplikace nebo změnu jejich regulace. LRS má potenciál překonat tato omezení tím, že má výrazně větší citlivost pro detekci SV, včetně CNV, a variant v opakovaných oblastech, což také umožňuje mapování duplikací a přesné chakerizace brekportů.
• Další složité přeskupení lze studovat u LR (tj. kruhové chromozomy, isochromozom, chromozomální translokace, somatické SV nalezené v nádorech atd.) K lepšímu pochopení molekulárních mechanismů patogenity. V těchto případech je k porozumění molekulární defektu odpovědné za onemocnění zapotřebí přesná definice zlomových bodů, genů zapojených do přeskupení, methylačního stavu a detekce vyvážených i nevyvážených SVS. Lepší definice komplexních SV, spolu s přesným popisem fenotypu, umožní stanovit korelaci genotypu-fenotypu.
• Třetí podskupinou pacientů způsobilých pro studii jsou pacienti s identifikovanou monolelní změnou v autozomálně recesivních (AR) genů. Za tímto účelem jsou vybraní pacienti s RGD, ve kterých již byla provedena rozsáhlá genetická analýza, tj. Celé exome sekvenování (WES), což vedlo k identifikaci monolelické mutace v genu spojeném s podmínkou AR, která je kompatibilní s pacientem s pacientem. fenotyp. Cílem je provést cílenou analýzu specifického genu za účelem hledání druhé mutace, která nebyla detekována předchozí analýzou (tj. Intronické varianty, SV, varianty v obtížných genomických oblastech).
• A konečně, pacienti s fenotypem, který je silně naznačující pro genetický stav, u nichž by z LRS mohlo těžit několik analýz, včetně WES, získaných negativních výsledků. Cílem je v této souvislosti použít přístup celý genomový LRS k identifikaci zmeškaných variant kódování v obtížně sekvenčních oblastech, variantách v nekódujících oblastech nebo SV.