Diagnostica di precisione in rare malattie genetiche e tumori - sequenziamento di lettura lunga (PREDICT-LRS)

Recentemente introdotto a lungo sequenziamento (LRS), anche indicato come sequenziamento di terza generazione, è una tecnologia rivoluzionaria con la capacità di sequenziare lunghe molecole di acidi nucleici (più lunghi di 10kb). L'accesso a sequenze accurate più lunghe ha migliorato la mappabilità e ha superato i limiti tecnici di NGS. L'applicazione di LRS a un'impostazione diagnostica potrebbe avere un impatto sul tasso di rilevamento e sulla resa diagnostica, portando a una migliore comprensione dell'eziologia, della prognosi e del rischio di recidiva di RGD, ma anche a un trattamento mirato. Uno dei principali vantaggi degli LR è il rilevamento di varianti strutturali bilanciate e sbilanciate (SV), inclusi riarrangiamenti complessi, con elevata sensibilità e accuratezza, attraverso un allineamento affidabile e una definizione precisa di breakpoint. Vari studi hanno anche riportato la sua utilità nell'identificazione delle varianti di codifica mancanti nelle regioni difficili da sequenza. Inoltre, questo metodo fornisce accesso alle informazioni sui cambiamenti di metilazione e la fase aplotipo in un singolo esperimento.

Tra le principali sfide della genetica moderna, vi sono identificati 4 sottogruppi di pazienti che trarrebbero beneficio dall'applicazione degli LR per caratterizzare meglio la diagnosi genetica e i meccanismi della malattia.

• Il primo sottogruppo di pazienti sono quelli con SV di significato sconosciuto o meccanismo incerto della malattia. Gli SV più diagnosticamente studiati, principalmente negli individui con NDD, sono le varianti del numero di copie (CNV), ovvero delezioni e duplicazioni, e il test genetico di primo livello per la loro identificazione è l'ibridazione genomica comparativa basata su array (ACGH). Questa analisi ha una resa diagnostica di circa il 10-20% su cui alcune limitazioni tecniche hanno un impatto negativo: scarsa sensibilità per i CNV a mosaico o varianti situate in regioni genomiche che sono difficili da analizzare (ricchi di GC o ripetuti) e incapacità di mappare le duplicazioni. In particolare, l'interpretazione clinica delle duplicazioni è impegnativa, a causa dell'incapacità di ACGH di rilevare se si verificano in tandem o sono duplicati e inseriti altrove nel genoma, quindi eventualmente interrompendo i geni coinvolti nella duplicazione o alterando la loro regolazione. LRS ha il potenziale per superare queste limitazioni avendo una sensibilità significativamente maggiore per il rilevamento di SV, compresi i CNV e delle varianti all'interno di regioni ripetute, consentendo anche la mappatura delle duplicazioni e la precisa Chacterizzazione dei Brekpoint.
• Altri riarrangiamenti complessi possono essere studiati con LRS (ad es. cromosomi ad anello, isocromosoma, traslocazioni cromosomiche, SV somatico che si trova nei tumori, ecc.) Per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi molecolari della patogenicità. In questi casi, la definizione precisa di punti di interruzione, dei geni coinvolti nel riarrangiamento, dello stato di metilazione e del rilevamento di SV sia bilanciati che sbilanciati è necessaria per comprendere il difetto molecolare responsabile della malattia. Una migliore definizione di SV complessi, insieme a una descrizione accurata del fenotipo, consentirà di determinare la correlazione del genotipo-fenotipo.
• Un terzo sottogruppo di pazienti idonei per lo studio sono quelli con alterazione monoallelica identificata nei geni autosomici recessivi (AR). A tale scopo, sono già eseguiti pazienti selezionati con RGD in cui è già stata eseguita un'ampia analisi genetica, ovvero l'intero sequenziamento dell'esoma (WES) fenotipo. L'obiettivo è condurre un'analisi mirata del gene specifico per cercare una seconda mutazione che non è stata rilevata dall'analisi precedente (ovvero varianti introniche, SV, varianti in regioni genomiche difficili).
• Infine, i pazienti con un fenotipo che è fortemente suggestivo per una condizione genetica, in cui diverse analisi, tra cui WES, hanno recuperato risultati negativi, potrebbero beneficiare di LRS. In questo contesto, l'obiettivo è applicare un intero approccio LRS del genoma per identificare le varianti di codifica mancanti nelle regioni difficili da sequenza, varianti in regioni non codificanti o SV.