识别 COPD 患者感冒后加重风险的特征

研究协议

确定 COPD 患者病毒性上呼吸道感染后恶化风险的生物标志物和临床特征

首席研究员：Patrick Mallia 博士合作研究员：Sebastian Johnston 教授 Sarah Elkin 博士

研究地点 该研究将在伦敦圣玛丽医院进行，该医院隶属于帝国理工学院医疗保健 NHS 信托基金。

1. 背景 COPD 恶化是医疗保健费用、发病率和死亡率的主要原因。 目前的疗法仅部分有效并且具有相当大的副作用，因此迫切需要新的疗法。 40 - 50% 的 COPD 恶化与病毒感染有关，检测到的最常见病毒是鼻病毒和流感 1,2。 最近出现了针对病毒感染的灵敏和快速诊断技术 3，并且已经开发出有效对抗鼻病毒和流感的药物 4，这使得抗病毒治疗成为 COPD 恶化的现实潜在治疗选择。 然而，我们对病毒感染和 COPD 恶化之间关系的理解仍然有限，在进行抗病毒治疗试验之前需要更多信息。

COPD 恶化的实验模型 我们在 COPD 患者中使用实验性鼻病毒感染开发了 COPD 恶化模型，这使我们能够以小心控制的方式研究许多结果，而自然发生的感染是不可能的5,6。 该模型提供了有关病毒感染与病情恶化之间关系的新数据。 鼻病毒感染后，受试者出现上呼吸道感染 (URTI) 症状，该症状在接种后第 2 天开始并在第 4 天达到高峰，随后出现典型的下呼吸道急性加重症状，在第 5 天开始并在第 9 天达到高峰气流阻塞和下呼吸道炎症也在第 9 天达到顶峰。最大病毒载量出现在第 4 天的鼻腔灌洗液和第 5 天的痰液中。 在自然发生的恶化中，患者会在恶化症状出现后 3-4 天就诊 7，我们的数据显示病毒复制的高峰可能在此时已经出现。 因此，在恶化时使用抗病毒药物进行干预可能为时已晚。 在我们的研究中，63% 的 COPD 受试者在实验性鼻病毒感染后出现细菌感染。 虽然病毒载量在第 5 天达到峰值，但大多数细菌感染发生在接种后第 12 天和第 15 天，这表明鼻病毒感染增加了对细菌感染的易感性。 因此，病毒感染的治疗可能具有减少继发性细菌感染的额外益处。

预测恶化的风险：来自实验模型的初步数据 从我们的实验模型获得的数据使我们能够评估初始 URTI 时标记与随后恶化严重程度的测量之间的关系。 峰值上呼吸道症状与峰值下呼吸道评分相关 (p=0.0037, r=0.58), 痰炎细胞计数 (p=0.018, r=0.5) 和痰病毒载量 (p=0.014, r=0.51）。 第 5 天呼气流量峰值下降与下呼吸峰值评分相关 (p=0.023, r=-0.47), 呼吸困难评分 (p=0.0079, r=-0.54) 和痰病毒载量 (p=0.03, r=-0.45)。 第 5 天的血液中性粒细胞与 FEV1 的峰值下降相关（p=0.0072， r=-0.55), 第 5 天的总白细胞计数，FEV1/FVC 出现峰值下降（p=0.04， r=-0.43) 和第 5 天的鼻腔灌洗病毒载量与 FEV1 峰值下降相关 (p=0.0186, r=-0.49)。 这些数据表明，在 COPD 患者的 URTI 期间测量的症状、气流阻塞、外周白细胞计数和病毒载量等参数与随后的下呼吸道症状、气流阻塞和气道炎症相关，并且可以预测恶化的风险。 然而，这项研究是在少数患有轻中度 COPD 的患者中进行的，这些发现需要在更大范围的 COPD 严重程度和自然感染的患者中进行探索。

生物标志物恶化定义为症状增加，诊断取决于患者和医疗保健提供者对症状的主观评估。 不存在可用于定义恶化的标志物（无论是生物学的还是生理学的）。 加重与气道炎症有关，但由于支气管肺泡灌洗和支气管内活检的侵入性太大，而且痰液和呼出气冷凝物过于复杂和耗时，无法在常规临床实践中直接测量炎症标志物。 血液很容易获得用于测量生物标志物，但尚未确定全身标志物反映气道炎症或与 COPD 恶化的临床结果相关。 鼻腔样本也很容易获得，并且有数据显示鼻腔炎症标志物与下气道炎症相关 8，我们已经报道，在实验性鼻病毒感染后，IL-8 和 IL-6 在鼻腔灌洗液中升高 5。 许多生物标志物已被研究作为 COPD 恶化的标志物和特定病因学的指标。 和肽素 9 和血清淀粉样蛋白 A (SAA)10 与 COPD 恶化的临床结果相关，干扰素诱导蛋白 10 (IP-10)11 和新蝶呤已被确定为病毒性呼吸道感染的潜在标志物 12,13，降钙素原被确定为细菌性呼吸道感染的标志物感染 14. 然而，这些标志物中没有一个被专门研究作为 COPD 中 URTI 后结果的预测因子。

病毒性 URTI 和 COPD 恶化之间的关系 我们的研究数据表明，可能需要在最初 URTI 时进行治疗以防止病毒引起的恶化。 然而，该策略存在治疗未恶化导致过度治疗的 URTI 的风险。 只有一项研究检查了 COPD 患者 URTI 后的恶化情况，发现 43% 的 URTI 之后出现恶化 15。 然而，在这项研究中，URTI 是从症状日记卡中回顾性确定的，因此不能证明这些症状是由病毒感染引起的。 高达 75% 的 COPD 患者在临床稳定时抱怨上呼吸道症状 16 因此，在本研究中，由病毒感染以外的因素引起的上呼吸道症状会削弱 URTI 与 COPD 恶化之间的关联。 真正的关联可能更高，只能通过感染的病毒学确认来确定。 此外，病毒性 URTI 后恶化的风险对于所有 COPD 患者可能并不相同，但可能会受到宿主因素的影响，例如 FEV1、既往恶化史和吸烟状况。 目前没有关于这些因素如何影响病毒性 URTI 后恶化风险的数据。 迄今为止，所有关于 COPD 恶化的研究都招募了出现恶化症状的患者。 因此，我们错过了调查先前 URTI 与恶化之间关系的机会。 本研究的目的是招募一组 COPD 患者，并在他们发生 URTI 时对其进行调查，以便以前瞻性的方式检查与随后恶化的关系。

2) 学习目标

1. 确定在 COPD 患者中进展为急性加重并确定特定病毒病因的 URTIs 中已确认病毒病因的比例。
2. 确定预测 URTI 进展为恶化并与恶化严重程度相关的临床、病毒和生物标志物。
3. 确定基线临床特征，以识别病毒性 URTI 后出现恶化的高风险患者。
4. 确定 COPD 患者病毒性 URTI 后细菌感染的频率和危险因素。
5. 开发一个结合基线患者特征、临床测量和生物标志物的模型，以预测 COPD 患者病毒性 URTI 后的恶化风险。

3) 方法 研究对象 将从圣玛丽医院的胸部和过敏诊所、帝国理工学院医疗保健 NHS 信托的帕丁顿部分以及威斯敏斯特和肯辛顿和切尔西当地的社区诊所招募 100 名 COPD 对象。

纳入标准 主要纳入标准是年龄在 40-85 岁之间并经肺活量测定法确诊为 COPD 的患者。

排除标准

• 难以理解英语的参与者将无法回答症状问卷。
• 患有其他疾病（例如晚期癌症）的参与者意味着他们的预期寿命少于 2 年，因此无法完成随访。
• 因经常去医院而难以出席的参与者也将被排除在外。

基线访视 在知情同意后，参与者将进行一次基线访视，届时他们将获得详细的临床特征，包括吸烟状况、合并症、恶化频率和药物的记录以及肺功能测量（FEV1、FVC、FEV1、/FVC、PEF、传递系数）。 将收集痰液、鼻液和血液，用于细菌和病毒定植的基线评估以及气道炎症和生物标志物的测量。 在研究过程中，参与者将每 3 个月进行一次重复访问，并进行相同的评估和抽样。 这样做的目的是记录临床状态的任何变化（例如 吸烟状况的变化），并确保如果发生感冒/病情恶化，将进行稳定的访问，以便在过去 3 个月内比较参数。

在基线访问之后，参与者将开始使用慢性肺病恶化工具 (EXACT) 记录下呼吸道症状，这是一种新的患者报告结果日记，已在 COPD 队列研究中得到验证17。 他们将继续他们通常的药物治疗和医疗护理，但如果他们出现感冒或病情加重的症状，将被建议联系调查人员。 他们将每周通过电话联系，以试图确定所有增加的呼吸道症状的发作。

冷访 如果受试者出现 URTI 症状，将建议他们向调查人员报告。 发生这种情况时，将在 24 小时内对他们进行“冷访问”——此访问的详细信息如下所示。

URTI 症状将使用威斯康星上呼吸道症状调查 (WURSS-21)18 问卷进行量化。 WURSS-21 是一种生活质量评估，用于衡量普通感冒对健康的影响，并已用于预测哮喘患者 URTI 后的恶化情况 19。 为了在没有感冒的 COPD 受试者中获得 WURSS-21 分数，稳定受试者的亚组将连续 14 天接受 WURSS-21。 将测量 FEV1、FVC、FEV1、/FVC 和 PEF，并采集鼻液、诱导痰和血液样本。

所有受试者将在感冒就诊后 7 天接受重复采样，除非他们在此之前出现病情恶化。 由于恶化是由症状定义的，而症状感知是主观的，因此这次访问的目的将是测量收集的临床样本中的客观标志物，例如肺功能和炎症标志物。 比较报告恶化和未报告恶化的参与者之间的这些将提供更客观的证据，证明除症状外还发生了恶化。

恶化就诊 当受试者发展为 URTI 时，他们将监测随后恶化的症状，如果发生这种情况，他们将进行进一步的就诊，称为“恶化就诊”。 如果参与者在没有先前的 URTI 的情况下出现恶化，他们也会被看到。 将进行包括身体检查、症状评分和肺活量测定在内的临床评估以评估恶化的严重程度，并收集与感冒就诊相同的临床样本。 受试者将在恶化发作后 2 周和 6 周进行进一步访问，并进行重复评估和临床取样。

里程碑 COPD 患者平均每年感冒 1-2 次，因此招募 100 名受试者并跟踪他们 24 个月（包括 4 个鼻病毒活动高峰期）应提供至少 200 次 URTI 发作以进行评估。 然后我们将需要 6 个月的时间来完成实验室分析和数据分析。

4) 研究程序 咽拭子 使用无菌干燥棉头拭子从咽部获取样本用于病毒检测。 这是在受试者坐着的情况下进行的。 确保充足的照明，并在需要时使用压舌板。 小心地从容器中取出棉签以确保尖端未被污染，然后擦拭咽部和软腭的背面，避开舌头。 将拭子放入干燥容器中并在分析前冷冻在 -80°C，另一根放入细菌培养基中。

鼻吸

将使用合成吸收矩阵 (SAM) 方法收集鼻衬液。 获得 50-100μL 的流体体积，50μL 足以使用 MSD 平台 (http://www.meso-scale.com) 测量多达 20 种分析物， 我们已经在人类研究中使用它来测定可溶性介质，并且可以获得定制的板来测量选定的介质。 SAM 条将在鼻孔中使用 2 分钟，以重复获得纯鼻 ELF 样本。 这是一种无痛微创手术，不需要任何局部麻醉。 取样后，将 SAM 置于含有 100μL 洗脱缓冲液（PBS/1% 牛血清白蛋白/1% Triton®）的 1mL 微量离心离心过滤管中。 为了确定 nasosorption 获得的流体体积, 从而确定 ELF 中可溶性介质的最终浓度, 必须知道采样前后 SAM 的重量。 必须遵循以下程序：

• 记录 SAM (DS) 的干重
• 记录微量离心管的干重（DT）
• 记录洗脱缓冲液 (CW) 中含有 SAM 的微量离心管的总重量
• 计算并记录 ELF 的重量 (mg):

ELF 的重量 = CW - (DT + DS + 100) （100mg 是 100μL 洗脱缓冲液的重量） SAM 将在干冰上运输到实验室。

洗鼻

使用以下技术进行鼻腔灌洗：

• 在 ICRRU 负压室发生的程序
• 使用注射器将 5mL 的 0.9% 盐水注入一个鼻孔，受试者坐着，头部向后倾斜。
• 将盐水在鼻子中保持 5 秒钟，然后吹入无菌罐中。 然后对另一个鼻孔重复该过程。
• 然后将液体等分到无菌微量离心管中并离心以分析细胞，上清液在-80°C下冷冻。

鼻腔灌洗液将用 PCR 分析呼吸道病毒。 任何鼻病毒阳性的样本都将用定量 PCR 进一步分析以确定病毒载量。

采血 将在基线访视时采集血液以分离血清以测量炎症标记物和测量 C 反应蛋白和全血细胞计数。 这些将在圣玛丽校区医学院大楼的呼吸医学实验室进行处理。

每次就诊时采集的血液总量为 20 毫升。

诱导痰 将使用标准方案诱导和处理痰20。 简而言之，参与者将通过计量吸入器和大容量间隔器预先服用 200 毫克沙丁胺醇，并测量基线 FEV1。 将使用 DeVilbiss UltraNeb99 超声波雾化器在 2 分钟内给予 3% 盐水，并再次测量 FEV1。 如果 FEV1 下降 20%，将停止该程序并进一步给予沙丁胺醇。 否则将继续该程序，每 2 分钟测量一次 FEV1，直到获得足够的痰样本。 痰液将在诱导后 2 小时内处理。 通过样品的宏观检查从唾液中选择痰栓，并选择等分试样并在 -80oC 下未经处理储存用于 qRT-PCR 病毒检测。 还将保留一份痰液用于细菌检测。 剩余的样品将被称重，0.1% 二硫苏糖醇 (DTT) 以 4ml DTT 与 1g 痰的比例添加，并且搅拌和过滤混合物。 加入相同体积的 PBS，离心滤液，分装上清液，-80°C 保存。 洗涤并重悬细胞沉淀，对细胞进行计数以获得总细胞计数。 使用 Shandon Diffquick 试剂盒（Thermo Shandon Ltd, Cheshire, UK）制备和染色细胞离心涂片，对研究状态进行盲法编码和计数以获得差异细胞计数。 细胞计数将表示为至少 400 个炎症细胞的百分比。

5) 监管问题 伦理批准 本研究已获得东伦敦研究伦理委员会的批准。 该研究将提交给帝国理工学院医疗保健 NHS 信托基金进行现场特定评估 (SSA)。 在接受参与者参加研究之前，首席研究员将需要一份研发批准函的副本。 该研究将根据第 18 届世界医学大会、1964 年赫尔辛基宣言及后来的修订通过的对参与人体受试者研究的医生的建议进行。

同意 只有在给出完整的解释、提供的信息传单、允许的考虑时间以及参与者可能已经回答的任何问题之后，才会征求每个参与者的同意进入研究。 将获得签署的参与者同意。 必须尊重参赛者无理由拒绝参赛的权利。 参与者进入研究后，如果临床医生认为这符合参与者的最大利益，则临床医生可以在任何阶段自由地对方案中指定的治疗进行替代治疗，但应记录这样做的原因。 在这些情况下，出于后续跟进和数据分析的目的，参与者仍留在研究中。 所有参与者都可以随时退出方案治疗，无需说明原因，也不会影响进一步治疗。

保密性首席研究员和所有研究团队将为参与研究的参与者保密，并遵守数据保护法。

Indemnity 伦敦帝国理工学院作为本研究的发起人持有适用于本研究的疏忽和非疏忽伤害保险政策。 这些都是通过联合研究办公室安排的。

赞助商伦敦帝国理工学院将作为本研究的主要赞助商。 委派的职责将分配给参与本研究的 NHS 信托。

资金 在帝国医疗保健 NHS 信托基金和帝国理工学院的生物医学研究中心 (BRC) 成功申请后，BRC 正在资助这项研究。 研究人员将不会收到任何超出其正常工资的额外报酬。 研究参与者的旅行费用将得到退还。

审计和检查 本研究可能会受到伦敦帝国理工学院作为赞助商和其他监管机构的职权范围内的检查和审计，以确保遵守 GCP 和 NHS 健康和社会保健研究治理框架（第 2 版）。

研究管理 研究的日常管理将由该项目的首席研究员 Patrick Mallia 博士协调。

出版政策 我们的期望是，经过分析，这项研究的数据将在医学和科学界广泛传播。 通过在地方、国家和国际会议上的演讲，我们希望在医学文献中广泛发表。 此外，我们在帝国理工学院有一个优秀的媒体部门，并在发表时宣传具有公共利益的研究。 不会公布任何识别参与者的信息。

6) 不良事件定义 不良事件 (AE)：患者或临床研究对象发生的任何不良医学事件。

严重不良事件 (SAE)：任何不幸和意外的医疗事件或影响：

• 结果死亡
• 危及生命——指受试者在事件发生时有死亡风险的事件；它不是指假设如果更严重的话可能会导致死亡的事件
• 需要住院
• 导致持续或严重的残疾或无行为能力
• 是先天性异常或出生缺陷

报告程序 应报告所有不良事件。 根据事件的性质，应遵循以下报告程序。 有关不良事件报告的任何问题都应首先向首席调查员提出。

非严重 AE 所有此类事件，无论是否预期，都应记录下来。

严重 AE 应填写 SAE 表格并在 24 小时内传真给首席研究员和发起人。

所有 SAE 都应报告给东伦敦研究伦理委员会，首席研究员认为该事件是：

• “相关”，即任何研究程序的管理结果；和
• “意外”，即协议中未列为预期发生的事件

相关和意外 SAE 的报告应在首席研究员意识到该事件后的 15 天内，使用 NRES SAE 表格提交给伦理、赞助商和研发办公室，用于非 IMP 研究。

报告 SAE 的详细联系方式 传真：020 7262 8913 联系 Patrick Mallia 博士 电话：020 7594 3751（周一至周五 09.00 - 17.00）

7) 跟踪记录 我们小组在哮喘和慢性阻塞性肺病的病毒感染领域拥有高质量的研究记录。 我们已经建立了呼吸道病毒 PCR 检测方案、鼻病毒定量 PCR 方案，并与 Imperial College Healthcare NHS Trust Microbiology Laboratory 合作进行半定量细菌培养。 我们已经建立了测量鼻液和痰液上清液中炎症介质的方案和经验，并且正在开发使用 MSD 平台的专业知识。 Elkin 博士在招募 COPD 患者队列进行纵向临床试验方面拥有丰富的经验。

8) 预期影响 这项研究将首次确定病毒性 URTI 与 COPD 患者病情加重之间的关系。 它将建立预测 URTI 后恶化风险的临床因素和生物标志物。 获得的数据将引起制药业和临床研究人员的极大兴趣，因为它将为病毒引起的 COPD 恶化的抗病毒疗法试验开辟道路。