COPD患者の風邪後の増悪リスクを特定する特徴

研究プロトコル

COPD患者におけるウイルス性上気道感染症後の増悪リスクを特定するバイオマーカーと臨床的特徴

主任研究者: パトリック・マリア博士 共同研究者: セバスチャン・ジョンストン教授 サラ・エルキン博士

研究会場 この研究は、インペリアル・カレッジ・ヘルスケアNHSトラストの一部であるロンドンのセント・メアリーズ病院で行われます。

1. 背景 COPD の悪化は、医療費、罹患率、死亡率の主な原因です。 現在の治療法は部分的にしか効果がなく、重大な副作用があるため、新しい治療法が早急に必要とされています。 COPD 悪化の 40 ～ 50% はウイルス感染に関連しており、最も一般的に検出されるウイルスはライノウイルスとインフルエンザです 1,2。 最近、ウイルス感染症に対する高感度かつ迅速な診断技術が利用可能になり 3、ライノウイルスやインフルエンザに効果的な薬剤が開発され 4、抗ウイルス療法が COPD 増悪に対する現実的な潜在的な治療選択肢となっています。 しかし、ウイルス感染と COPD 悪化の関係についての理解は依然として限定的であり、抗ウイルス療法の試験が実施される前にさらなる情報が必要です。

COPD 増悪の実験モデル 我々は、COPD 患者における実験的ライノウイルス感染を使用した COPD 増悪モデルを開発しました。これにより、自然発生的な感染では不可能な、慎重に制御された方法で多くの転帰を研究することができます。 このモデルは、ウイルス感染と増悪との関係に関する新しいデータを提供しました。 ライノウイルス感染後、被験者は接種後 2 日目に始まり 4 日目にピークとなる上気道感染症 (URTI) の症状を発現し、続いて 5 日目に始まり 9 日目にピークとなる急性増悪の典型的な下気道症状が現れました。気流閉塞と下気道の炎症も 9 日目にピークに達し、最大のウイルス量は鼻洗浄では 4 日目、喀痰では 5 日目に発生しました。 自然に発生する増悪では、患者は増悪症状の発症後 3 ～ 4 日後に現れます 7 が、ウイルス複製のピークはこの時点までにすでに発生している可能性が高いことを私たちのデータは示しています。 したがって、増悪時に抗ウイルス薬を投与しても手遅れになる可能性があります。 私たちの研究では、COPD被験者の63％が実験的ライノウイルス感染後に細菌感染症を発症しました。 ウイルス量は5日目にピークに達しましたが、ほとんどの細菌感染は接種後12日と15日後に発生しました。これは、ライノウイルス感染が細菌感染に対する感受性を高めることを示唆しています。 したがって、ウイルス感染症の治療には、細菌の二次感染を減らすという追加の利点がある可能性があります。

増悪リスクの予測: 実験モデルからの予備データ 実験モデルから得られたデータにより、最初の URTI 時のマーカーとその後の増悪重症度の尺度の間の関係を評価することができました。 上気道症状のピークは下気道スコアのピークと相関していた (p=0.0037、 r=0.58)、喀痰炎症細胞数 (p=0.018、 r=0.5) および喀痰ウイルス量 (p=0.014、 r=0.51）。 5 日目のピーク呼気流量の低下は、ピーク下部呼吸スコアと相関していました (p=0.023、 r=-0.47)、 息切れスコア (p=0.0079、 r=-0.54) および喀痰ウイルス量 (p=0.03、 r=-0.45)。 5 日目の血液好中球は、FEV1 のピーク低下と相関していました (p=0.0072、 r=-0.55)、 FEV1/FVC のピーク低下を伴う 5 日目の総白血球数 (p=0.04、 r=-0.43)、5日目の鼻洗浄ウイルス量はFEV1のピーク低下と相関していた(p=0.0186、 r=-0.49)。 これらのデータは、COPD患者のURTI中に測定された症状、気流閉塞、末梢白血球数、ウイルス量などのパラメータが、その後の下気道症状、気流閉塞、気道の炎症と相関しており、増悪のリスクを予測できる可能性があることを示唆している。 ただし、この研究は軽度から中等度の COPD 患者を対象としたものであり、これらの所見は、自然発生感染症を伴うより広範囲の COPD 重症度の患者のより大規模なコホートで調査する必要があります。

バイオマーカー 増悪は症状の増加によって定義され、診断は患者と医療提供者による症状の主観的な評価に依存します。 増悪を定義するために使用できる生物学的マーカーも生理学的マーカーも存在しません。 増悪は気道の炎症に関連していますが、気管支肺胞洗浄や気管支内生検は侵襲的すぎ、喀痰や呼気の凝縮物は複雑すぎて時間がかかるため、炎症マーカーを直接測定することは困難であり、日常の臨床診療では実践できません。 バイオマーカーの測定には血液を簡単に入手できますが、全身マーカーが気道の炎症を反映していることや、COPD 増悪の臨床転帰と相関していることは確立されていません。 鼻サンプルも簡単に入手でき、鼻の炎症マーカーが下気道の炎症と相関することを示すデータがあり 8、実験的ライノウイルス感染後の鼻洗浄液で IL-8 および IL-6 が上昇することを報告しています 5。 COPD 増悪のマーカーとして、また特定の病因の指標として、多くのバイオマーカーが研究されています。 コペプチン 9 と血清アミロイド A (SAA) 10 は COPD 増悪の臨床転帰と相関しており、インターフェロン誘導性タンパク質 10 (IP-10) 11 とネオプテリンはウイルス性呼吸器感染症の潜在的なマーカーとして同定されており 12,13、プロカルシトニンは細菌性呼吸器感染症のマーカーとして同定されています。感染症14． しかし、これらのマーカーはいずれも、COPD における URTI 後の転帰の予測因子として具体的に研究されていません。

ウイルス性 URTI と COPD 増悪の関係 私たちの研究のデータは、ウイルスによる増悪を防ぐには、初回 URTI の時点での治療が必要である可能性があることを示唆しています。 しかし、この戦略は、悪化に進行しないURTIを治療することになり、過剰治療につながる危険性があります。 COPD患者のURTI後の増悪を調査した研究は1件のみで、URTIの43%で増悪が続いていることが判明した15。 しかし、この研究では、URTI は症状日記カードから遡及的に特定されたため、症状がウイルス感染によって引き起こされたことは証明されませんでした。 COPD 患者の最大 75% は、臨床的に安定している場合に上気道症状を訴えます 16。そのため、ウイルス感染以外の要因によって引き起こされる上気道症状は、この研究における URTI と COPD 増悪との関連性を弱めるものと考えられます。 本当の関連性はさらに高い可能性が高く、感染のウイルス学的確認によってのみ判断できます。 また、ウイルス性URTI後の増悪リスクはすべてのCOPD患者で同じではなく、FEV1、過去の増悪歴、喫煙状況などの宿主因子の影響を受ける可能性があります。 現時点では、これらの要因がウイルス性 URTI 後の増悪リスクにどのように影響するかに関するデータは入手できません。 これまでの COPD 増悪に関するすべての研究では、増悪の症状が現れた患者を対象としてきました。 したがって、以前のURTIと増悪との関係を調査する機会が逸されてきた。 この研究の目的は、COPD患者のコホートを募集し、URTIを発症した際に調査し、その後の増悪との関係を前向きに検討できるようにすることである。

2) 研究の目的

1. COPD患者において、急性増悪に進行するウイルス病因が確認されたURTIの割合を確立し、特定のウイルス病因を決定する。
2. URTIの増悪への進行を予測し、増悪の重症度と相関する臨床的、ウイルス的、生物学的マーカーを特定すること。
3. ウイルス性URTI後に増悪を発症するリスクが高い患者を特定するベースラインの臨床的特徴を決定する。
4. COPD患者におけるウイルス性URTI後の細菌感染の頻度と危険因子を判定する。
5. COPD患者におけるウイルス性URTI後の増悪リスクを予測する、ベースラインの患者特性、臨床測定値、バイオマーカーを組み合わせたモデルを開発する。

３）方法 研究対象者 １００人のＣＯＰＤ対象者のコホートを、インペリアル・カレッジ・ヘルスケアＮＨＳトラストのパディントン部分であるセント・メアリーズ病院の胸部アレルギー診療所、およびウェストミンスター、ケンジントン、チェルシーの地元地域内の地域診療所から募集する。

包含基準 主な包含基準は、肺活量測定により COPD の診断が確認された 40 ～ 85 歳の患者である。

除外基準

• 英語の理解が困難な参加者は、症状のアンケートに答えることができません。
• 進行がんなどの別の病状を患っている参加者は、余命が2年未満であるため、追跡調査を完了することができません。
• また、頻繁に通院することが困難な方も対象外とさせていただきます。

ベースライン訪問 インフォームドコンセントに続いて、参加者はベースライン訪問を受け、喫煙状況、併存疾患、増悪頻度、投薬の記録、肺機能の測定（FEV1、FVC、FEV1、/FVC、PEF、伝達係数）。 細菌およびウイルスの定着のベースライン評価、気道の炎症およびバイオマーカーの測定のために、喀痰、鼻水および血液が収集されます。 研究期間中、参加者は同じ評価とサンプリングを3か月ごとに繰り返し訪問します。 この目的は、臨床状態の変化を文書化することです（例: 喫煙状況の変化）、また、風邪や増悪が発生した場合には、過去 3 か月以内のパラメーターを比較するために安定した来院が行われることを確認します。

ベースライン訪問の後、参加者は、COPD コホート研究で検証されている新しい患者報告転帰日記である慢性肺疾患増悪ツール (EXACT) を使用して下気道症状の記録を開始します。 彼らは通常の投薬と治療を継続しますが、風邪や悪化の症状が現れた場合は研究者に連絡するようアドバイスされます。 呼吸器症状の増加をすべて特定するために、毎週電話で連絡が取られます。

風邪の訪問 被験者は、URTI の症状を発症した場合には研究者に報告するようアドバイスされます。 これが発生した場合、彼らは 24 時間以内に「コールド訪問」として診察を受けます。この訪問の詳細は以下に示されています。

URTI の症状は、ウィスコンシン上部呼吸器症状調査 (WURSS-21)18 アンケートを使用して定量化されます。 WURSS-21 は、風邪の健康関連の影響を測定する生活の質の評価であり、喘息患者の URTI 後の増悪を予測するために使用されています 19。 風邪のないCOPD被験者のWURSS-21スコアを取得するために、安定した被験者のサブグループに連続14日間WURSS-21を投与する。 FEV1、FVC、FEV1/FVCおよびPEFが測定され、鼻水、誘発された喀痰および血液のサンプルが収集されます。

すべての被験者は、それ以前に悪化が生じない限り、風邪の訪問の7日後に再度サンプリングを行うことになります。 増悪は症状によって定義され、症状の認識は主観的なものであるため、この訪問の目的は、収集された臨床サンプル中の肺機能や炎症マーカーなどの客観的なマーカーを測定することになります。 増悪を報告した参加者と報告しなかった参加者の間でこれらを比較すると、症状に加えて増悪が発生したことのより客観的な証拠が得られます。

増悪来院 被験者がURTIを発症した場合、その後の増悪の症状を監視し、これが発生した場合には、「増悪来院」と呼ばれるさらなる来院を受けることになります。 参加者が先行する URTI なしで増悪を発症した場合も検査されます。 増悪の重症度を評価するために、身体検査、症状スコア、肺活量測定を含む臨床評価が実施され、風邪の訪問と同じ臨床サンプルが収集されます。 被験者は、増悪の発症から2週間後と6週間後にさらに来院され、評価と臨床サンプリングが繰り返されます。

マイルストーン COPD 患者は平均して年に 1 ～ 2 回の風邪をひくため、100 人の被験者からなるコホートを募集し、ライノウイルス活動のピークとなる 4 シーズンを含めて 24 か月間追跡すると、少なくとも 200 回の URTI エピソードが得られ、評価できるはずです。 その後、実験室での分析とデータの分析が完了するまでに 6 か月かかります。

4) 研究手順 喉スワブ ウイルス検出のために咽頭からサンプルを採取するために、滅菌乾燥綿棒を使用します。 これは被験者が座った状態で行われます。 適切な照明を確保し、必要に応じて舌圧子を使用します。 先端が汚染されていないことを確認するために綿棒を容器から慎重に取り出し、舌を避けて咽頭背側と軟口蓋を綿棒で拭きます。 スワブを乾燥した容器に入れ、分析前に -80°C で凍結し、もう 1 つを細菌培養培地に入れます。

経鼻吸収

鼻粘膜液は合成吸収マトリックス (SAM) 法を使用して収集されます。 50 ～ 100 μL の液量が得られ、MSD プラットフォーム (http://www.meso-scale.com) を使用して最大 20 の分析物を測定するには 50 μL で十分です。 これは人間の研究で可溶性メディエーターのアッセイにすでに使用されており、選択したメディエーターを測定するためのカスタムメイドのプレートを入手できます。 SAM のストリップを鼻孔内で 2 分間使用して、純粋な鼻 ELF のサンプルを繰り返し取得します。 局所麻酔を必要としない、痛みの少ない低侵襲手術です。 サンプリング後、SAM を 100μL の溶出緩衝液 (PBS/1% ウシ血清アルブミン/1% Triton®) を含む 1mL 微量遠心分離スピンフィルターチューブに入れます。 鼻腔吸収によって得られる体液の量、つまり ELF 中の可溶性メディエーターの最終濃度を決定するには、サンプリング前後の SAM の重量を知る必要があります。 次の手順に従う必要があります。

• SAM (DS) の乾燥重量を記録します。
• 微量遠心分離管の乾燥空重量 (DT) を記録します。
• 溶出バッファー (CW) に SAM を含む微量遠心管の合計重量を記録します。
• ELF の重量 (mg) を計算して記録します。

ELF の重量 = CW - (DT + DS + 100) (100mg は 100μL の溶出バッファーの重量です) SAM はドライアイスに乗せて研究室に輸送されます。

鼻洗浄

鼻洗浄は次の方法で行われます。

• ICRRUの陰圧室で行われる手順
• 被験者が頭を後ろに傾けて座った状態で、注射器を使用して 0.9% 生理食塩水 5 mL を一方の鼻孔に注入します。
• 生理食塩水を鼻の中に5秒間保持した後、滅菌ポットに吹き込みます。 次に、この手順をもう一方の鼻孔に対して繰り返します。
• 次いで、液体を滅菌微量遠心管に等分し、細胞の分析のために遠心分離し、上清を-80℃で凍結します。

鼻洗浄液は、呼吸器ウイルスについて PCR で分析されます。 ライノウイルス陽性のサンプルは、ウイルス量を決定するために定量的 PCR でさらに分析されます。

採血 炎症マーカーの測定、C 反応性タンパク質および全血球数の測定のための血清の分離のために、ベースライン訪問時に血液が採取されます。 これらは、セント メアリーズ キャンパスの医学部棟にある呼吸器医学研究室で処理されます。

各訪問で採取される血液の総量は 20mL になります。

誘発された喀痰 喀痰は、標準的なプロトコルを使用して誘発および処理されます20。 簡単に説明すると、参加者は定量吸入器と大容量スペーサーを介して200mgのサルブタモールを前投薬され、ベースラインFEV1が測定されます。 DeVilbiss UltraNeb99 超音波ネブライザーを使用して 3% 生理食塩水を 2 分間で投与し、FEV1 を再度測定します。 FEV1が20%低下した場合、処置は中止され、さらにサルブタモールが投与されます。 それ以外の場合は、適切な喀痰サンプルが採取されるまで手順が続行され、2 分ごとに FEV1 が測定されます。 喀痰は導入後2時間以内に処理されます。 喀痰プラグは、サンプルの肉眼検査によって唾液から選択され、アリコートが選択され、ウイルス検出のためのqRT-PCRのために処理されずに-80℃で保存されます。 細菌検出のために喀痰の一部も保管されます。 残りのサンプルを秤量し、０．１％ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を、喀痰１ｇに対してＤＴＴ４ｍｌの割合で加え、混合物を撹拌し、濾過する。 同量のPBSを添加し、濾液を遠心分離し、上清を等分して-80℃で保存した。 細胞ペレットを洗浄して再懸濁し、細胞を計数して総細胞数を取得します。 サイトスピンは、Shandon Diffquick キット (Thermo Shandon Ltd、英国チェシャー州) を使用して調製および染色され、コード化され、状態を研究するためにブラインドで計数され、差分細胞数が得られます。 細胞数は、少なくとも 400 個の炎症細胞のパーセンテージとして表されます。

5) 規制上の問題 倫理的承認 この研究についてはイーストロンドン研究倫理委員会から承認を得ています。 この研究は、インペリアル・カレッジ・ヘルスケアNHSトラストの部位別評価（SSA）のために提出される予定です。 研究主任は、参加者を研究に受け入れる前に、研究開発承認書のコピーを要求します。 この研究は、第18回世界医学総会、1964年のヘルシンキ宣言、およびその後の改訂版で採択された、人を対象とした研究に携わる医師に対する推奨事項に従って実施されます。

同意 研究に参加するための同意は、十分な説明が行われ、情報リーフレットが提供され、考慮の時間が与えられ、参加者が回答した質問があった場合にのみ、各参加者に求められます。 署名された参加者の同意が得られます。 理由を示さずに参加を拒否する参加者の権利は尊重されなければなりません。 参加者が研究に参加した後、臨床医は、それが参加者の最善の利益であると判断した場合、どの段階でもプロトコールで指定された治療に代わる治療を自由に行うことができますが、そうする理由は記録される必要があります。 このような場合、参加者は追跡調査とデータ分析の目的で研究に残ります。 すべての参加者は、理由を提示することなく、またさらなる治療を妨げることなく、いつでもプロトコール治療から自由に中止することができます。

秘密保持 主任研究者および研究チーム全員は、研究に参加する参加者の秘密を保持し、データ保護法を遵守します。

この研究のスポンサーであるロンドンのインデムニティ インペリアル カレッジは、この研究に適用される過失および非過失損害保険契約を結んでいます。 これらは共同研究室を通じて取りまとめられています。

スポンサーのインペリアル・カレッジ・ロンドンがこの研究のメインスポンサーとして活動します。 この研究に参加するNHSトラストには、委任された責任が割り当てられます。

資金提供 インペリアル・ヘルスケアNHSトラストおよびインペリアル・カレッジの生物医学研究センター(BRC)への申請が成功し、BRCはこの研究に資金提供を行っています。 調査員は通常の給与を超える追加の支払いを受け取ることはありません。 研究の参加者には旅費が返金されます。

監査と検査 この研究は、GCP および健康と社会的ケアのための NHS 研究ガバナンス フレームワーク (第 2 版) の順守を確保するために、スポンサーおよびその他の規制機関としての権限に基づいて、インペリアル カレッジ ロンドンによる検査と監査の対象となる場合があります。

研究管理 研究の日常的な管理は、プロジェクトの主任研究員であるパトリック・マリア博士によって調整されます。

出版ポリシー 私たちは、この研究のデータが分析後に医学界および科学界に広く配布されることを期待しています。 私たちは、地方、国内、国際的な会議での発表を促進し、医学文献に広く掲載したいと考えています。 さらに、インペリアルカレッジには優れたメディア学部があり、公共の関心のある研究は出版時に公表されます。 参加者を特定する情報は公開されません。

6) 有害事象の定義 有害事象 (AE): 患者または臨床研究対象者における望ましくない医学的出来事。

重篤な有害事象 (SAE): 以下のような望ましくない予期せぬ医学的出来事または影響。

• 死亡につながる
• 生命を脅かす - 事象発生時に被験者が死亡の危険にさらされていた事象を指します。それは、もしそれがより重度であった場合に死亡を引き起こした可能性があると仮定される出来事を指すものではありません。
• 入院が必要
• 持続的または重大な障害または無能力をもたらす
• 先天異常または先天異常である

報告手順 すべての有害事象は報告される必要があります。 イベントの性質に応じて、以下の報告手順に従う必要があります。 有害事象の報告に関する質問は、まず主任研究者に宛ててください。

非重篤な有害事象 予期されたかどうかにかかわらず、そのようなイベントはすべて記録される必要があります。

重篤な有害事象 SAE フォームに記入し、24 時間以内に主任研究者と治験依頼者にファックスで送信する必要があります。

すべてのSAEはイーストロンドン研究倫理委員会に報告されるべきであり、主任調査官の見解では、その出来事は次のとおりでした。

• 「関連する」、つまり、研究手順のいずれかの管理から生じたもの。と
• 「予期しない」、つまりプロトコルに予期される出来事としてリストされていないイベント

関連する予期しない SAE の報告は、主任研究者がその事象を認識してから 15 日以内に、非 IMP 研究用の NRES SAE フォームを使用して、倫理委員会、スポンサー、および研究開発オフィスに提出する必要があります。

SAE 報告に関する連絡先 ファックス: 020 7262 8913 パトリック・マリア博士の対応のため 電話: 020 7594 3751 (月曜日から金曜日 09.00 - 17.00)

7) 実績 私たちのグループは、喘息および COPD におけるウイルス感染症の分野で質の高い研究の確立された実績を持っています。 当社は呼吸器系ウイルスの PCR 検出、ライノウイルスの定量的 PCR のプロトコルを確立し、半定量的な細菌培養についてはインペリアル カレッジ ヘルスケア NHS トラスト微生物研究所と協力しています。 当社は、鼻水および喀痰上清中の炎症性メディエーターの測定に関するプロトコルと経験を確立しており、MSD プラットフォームの使用に関する専門知識を開発しています。 エルキン博士は、長期的臨床試験のために COPD 患者のコホートを募集した経験があります。

8) 予想される影響 この研究は、ウイルス性 URTI と COPD 患者の増悪との関係を明らかにする最初の研究となる。 それは、URTI後の増悪のリスクを予測する臨床因子とバイオマーカーを確立するでしょう。 得られたデータは、ウイルス誘発性 COPD 増悪に対する抗ウイルス療法の治験への道を開くものであるため、製薬業界や臨床研究者にとって非常に興味深いものとなるでしょう。