类风湿性关节炎和强直性脊柱炎骨细胞活性的差异

目标：

1. 评估免疫系统细胞对 RA、AS 患者和健康供体骨转换调节的影响（任务 2）。
2. 分析 RA、AS 患者和健康供体亚组中的破骨细胞前体及其分化为功能齐全的破骨细胞（任务 3、4 和 6）。
3. 研究 RA 和 AS 患者亚组的成骨细胞分化潜能和活性（任务 5 和 6）
4. 在接受 TNF 阻滞剂治疗的 RA 和 AS 患者亚组中评估治疗对骨细胞分化和功能的影响（任务 2、3、4 和 5）。

工作计划和时间表 开始日期：2011 年 7 月。 完成日期：2013 年 7 月 任务 1 - 诊断为 RA（根据修订后的美国风湿病协会标准，1988 年）和诊断为 AS（根据欧洲脊椎关节病研究组标准，1991 年）的患者将招募圣玛丽亚医院 (HSM) 部门进行这项研究。 25 名活动性 RA 患者（疾病活动评分 28 (DAS28)>3.2）和 25 名活动性 AS（Bath 强直性脊柱炎疾病活动指数 (BASDAI)>4）患者将被纳入研究。 将招募 15 名性别和年龄相匹配的健康供体并用作对照组。

将向患者提交一份临床方案，其中包括有关性别、年龄、病程、既往治疗、类风湿因子和抗环瓜氨酸肽抗体的存在、人类白细胞抗原 (HLA)-B27 状态、DAS28 评分和健康评估问卷的信息- HAQ（健康评估问卷，针对 RA 患者）、BASDAI、马斯特里赫特强直性脊柱炎附着点炎评分 (MASES)、Bath 强直性脊柱炎功能指数 - BASFI（针对 AS 患者）和强直性脊柱炎疾病活动评分 (ASDAS)。 在开始使用糖皮质激素和改善疾病的抗风湿药物（DMARDs：甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶和来氟米特）治疗之前以及这些药物达到稳定剂量后 3 个月，将从患者身上采集血液。 对于那些后来开始使用 TNF 阻滞剂的人，将在开始治疗 6 个月后收集血样。 因为预计该初始队列中只有少数人需要用 TNF 拮抗剂治疗，第二组 25 名 RA 和 25 名 AS 患者被选为开始使用 TNF 拮抗剂，将在开始药物之前和 6 个月后进行评估。

在执行任何特定于方案的程序之前，将获得所有患者的书面知情同意书，并且本研究将根据管理临床试验的法规进行，例如在东京 (2004) 修订的赫尔辛基宣言。 本研究经 HSM 伦理委员会批准。

以下任务中的所有程序将在 RA 和 AS 患者（血清和血液）和健康供体（血清）中执行，除非另有说明。

任务 2 - 炎症刺激和骨转换标志物的研究 免疫系统细胞亚群（中性粒细胞、B 和 T 细胞亚群，包括 Th17 细胞）将通过流式细胞术分析表面 RANKL 表达。

IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-20、IL-23、TNF 和骨调节蛋白（OPG、sRANKL、硬化蛋白和 dickkopf-1）等促炎细胞因子将通过 ELISA 进行定量。 还将研究骨降解酶，如抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP)5b 和骨转换标志物，如 I 型胶原蛋白羧基末端交联端肽 (ICTP) 和前胶原 1 型氨基末端前肽 (P1NP)。

从流式细胞术实验和蛋白质定量中获得的数据将在疾病治疗前后以及与健康供体之间进行比较。 这将使我们能够了解未经治疗的患者全身和局部炎症环境的疾病特异性差异，以及不同疗法对同一环境的影响。

任务 3 - 分析破骨细胞前体及其向功能性破骨细胞的分化循环 CD14+ 细胞将通过分析 HLA-DR、分化簇 (CD)16、CD86、CD11b 和 CD62L 以及破骨细胞分化相关蛋白等标记物来表征，如表面整合素 CD51/CD61（αVβ3 整合素）、RANK（nf-kappa β 受体激活剂）和流式细胞仪检测的降钙素受体。

为了充分表征破骨细胞前体，破骨细胞相关基因如 DC-STAMP、MITF（小眼相关转录因子）、CTSK（组织蛋白酶 K）、TRACP 和 ATP6v0d2 在 CD14+ 细胞中的表达将通过实时定量聚合酶评估链式反应 (RT-qPCR)。 获得的结果将用管家基因 β 葡萄糖醛酸酶 (GUSB) 和磷酸甘露糖变位酶-1 (PMM1) 进行标准化。

从流式细胞术和基因表达实验中获得的数据将在接受治疗和未接受治疗的患者以及健康供体之间进行比较。 这项任务将为我们提供有关 CD14+ 单核细胞亚群疾病特异性变化的定量信息，并使我们能够了解治疗对循环前体细胞的影响。

任务 4 - 分化的破骨细胞的功能和细胞动力学 分离的 CD14+ 单核细胞将在 M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）和 hrRANKL（nf-kappa β 配体的人类重组受体激活剂）存在下于 37º 培养 21 天, 5% CO2 在多孔培养板中。

将在培养的第 7、14 和 21 天分析破骨细胞以评估细胞动力学。 破骨细胞特异性基因的表达将在这些时间点通过 RT-qPCR 进行分析（参见任务 3）。 将进行流式细胞术分析以评估 CD51/CD61 和 RANK 表面表达。 将在时间点（第 7、14 和 21 天）期间从患者和健康对照获得的数据与从前体细胞获得的相同数据进行比较。

在第 21 个培养日，细胞将用于两种功能测定：TRAP 染色和再吸收测定。 在 TRAP 染色测定中，我们将通过计算具有 3 个以上细胞核（破骨细胞）的 TRAP 阳性多核细胞来评估培养物中形成的破骨细胞的数量。 将此值与培养板中 CD14+ 单核细胞的细胞核计数进行比较将使我们能够确定这些前体的融合指数。 通过在骨切片上培养单核细胞进行再吸收测定，使我们能够测量功能性破骨细胞的再吸收活性。 这将通过甲苯胺蓝染色的骨切片的图像分析来测量，其中吸收区域获得蓝色到紫色。 对前体融合率和破骨细胞再吸收区域的分析将使我们能够确定 RA 和 AS 患者与健康供体之间破骨细胞功能的差异。

将研究单核细胞和破骨细胞关于 RANK/RANKL 和 αVβ3 整合素和 c-fms 信号通路，这些信号通路导致 TRAF6、酪氨酸激酶 Src 和细胞外信号调节激酶 (ERK)1/2 激活 NF- kB 等转录因子。 这些信号传导途径将使用 Luminex xMAP 平台和 EpiQuant 细胞信号传导分析 (Millipore) 进行研究。 比较未经治疗的患者和对照组的结果将使我们能够了解与 RA 相比，AS 中的破骨细胞分化/激活经典途径是否存在损伤。

从接受过治疗和未接受过治疗的患者身上获得的结果将有助于深入了解治疗对破骨细胞分化和功能的作用。 比较未经治疗的患者和健康供体的总体结果将使我们能够了解这些病理中破骨细胞分化和激活之间的主要区别。

任务 5 - 成骨细胞的功能和细胞动力学 在接受髋关节置换术或颈椎手术的 RA 和 AS 患者的一个亚组中，将研究成骨细胞分化。 手术后立即从样本中取出一小块骨小梁 (1cm3) 以分离成骨细胞。 分离后，成骨细胞将在补充有维生素 D3 (10-8M) 的 Dulbecco 最低限度必需培养基 (DMEM) 中培养，细胞将在 80% 汇合时进行研究。 将通过甲基噻唑四唑 (MTT) 测定（细胞增殖）、碱性磷酸酶染色和矿化结节形成在体外研究成骨细胞的功能。 细胞也将用于 RNA 提取和基因表达分析。将分析编码骨桥蛋白、I 型胶原蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶、RANKL、骨保护素、runx2 和 osterix 等蛋白质的特定基因，以表征分离的细胞。 这些结果将使我们能够了解疾病之间成骨细胞分化和活性的差异。

任务 6 - 骨基因表达分析 在接受髋关节置换术或颈椎手术的 RA 和 AS 患者亚组中，我们将在 -80ºC 下冷冻骨样本。 在骨骼仍然冷冻的情况下，一小部分骨小梁样本将在低温研磨机中磨成细粉，然后使用 TRIzol 试剂进行 RNA 提取。 生成的 RNA 将在生物分析仪中进行完整性评估和量化。 因此，提取的 RNA 将是骨骼、血液、成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、脂肪细胞和骨髓细胞中存在的 RNA 的总和。

骨微环境和体外研究细胞中的基因表达将通过 RT-PCR 进行评估。 编码来自成骨细胞和破骨细胞的蛋白质的特定基因，例如骨桥蛋白、I 型胶原蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶、RANKL、骨保护素、runx2、osterix、组织蛋白酶 K、β3 整合素亚基、降钙素受体、ATP 酶亚基 d2、TRAF6、RANK、TRAP ，将研究共同受体 OSCAR 和 TREM-2 等。 还将通过特定基因 SOST、Dkk1、DMP-1、Phex、E11 抗原、MEPE 和 CD44 的表达来评估骨细胞的活性。 还将研究编码炎性细胞因子 IL-1、IL-6、IL-17 和 TNF 的基因。

为了评估 PCR 效率，标准曲线将从提取自骨矿物质密度正常且没有其他可能影响骨代谢的疾病的个体的冷冻骨样本中提取的 RNA 构建标准曲线。 感兴趣的破骨细胞、成骨细胞和骨细胞基因将通过标准曲线法进行定量。

骨骼样本的 RNA 表达研究将使我们能够了解局部细胞活动，并表征骨细胞及其在疾病背景下的功能。