Differenze nell'attività delle cellule ossee tra artrite reumatoide e spondilite anchilosante

Obiettivi:

1. Valutare l'influenza delle cellule del sistema immunitario nella modulazione del turnover osseo in pazienti con AR, AS e donatori sani (Task 2).
2. Analizzare i precursori degli osteoclasti e la loro differenziazione in osteoclasti completamente funzionali in un sottogruppo di pazienti con AR, AS e donatori sani (Task 3, 4 e 6).
3. Studiare il potenziale e l'attività di differenziazione degli osteoblasti in un sottogruppo di pazienti con RA e AS (Task 5 e 6)
4. Valutare l'effetto della terapia sulla differenziazione e funzione delle cellule ossee in un sottogruppo di pazienti con AR e AS trattati con bloccanti del TNF (Task 2, 3, 4 e 5).

Programma e calendario dei lavori Data di inizio: luglio 2011. Data di conclusione: luglio 2013 Task 1 - Pazienti Pazienti con diagnosi di AR (secondo i criteri rivisti dell'American Rheumatism Association, 1988) e diagnosi di AS (secondo i criteri dell'European Spondyloarthropathy Study Group, 1991) seguiti nel Rheumatology and Bone and Metabolic Diseases Dipartimento dell'Ospedale de Santa Maria (HSM) sarà reclutato per questo studio. Venticinque pazienti con RA attiva (Disease Activity Score 28 (DAS28)>3.2) e 25 pazienti con AS attiva (Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index (BASDAI)>4) saranno inclusi nello studio. Quindici donatori sani, abbinati per sesso ed età, saranno reclutati e utilizzati come gruppo di controllo.

I pazienti saranno sottoposti a un protocollo clinico che include informazioni su sesso, età, durata della malattia, terapie precedenti, presenza di anticorpi anti-fattore reumatoide e peptide citrullinato ciclico, stato dell'antigene leucocitario umano (HLA)-B27, punteggio DAS28 e questionario di valutazione della salute - HAQ (Health Assessment Questionnaire, per pazienti con AR), BASDAI, Maastricht Ankylosing Spondylitis Enthesitis Score (MASES), Bath Ankylosing Spondylitis Functional Index - BASFI (per pazienti con AS) e Ankylosing Spondylitis Disease Activity Score (ASDAS). Il sangue verrà prelevato dai pazienti prima di iniziare il trattamento con glucocorticoidi e farmaci antireumatici modificanti la malattia (DMARD: metotrexato, sulfasalazina e leflunomide) e 3 mesi dopo aver raggiunto una dose stabile di questi farmaci. Per coloro che inizieranno la terapia con anti-TNF, i campioni di sangue verranno raccolti dopo 6 mesi dall'inizio della terapia. Poiché si prevede che solo una minoranza di questa coorte iniziale dovrà essere trattata con antagonisti del TNF, un secondo gruppo di 25 pazienti affetti da AR e 25 AS, selezionati per iniziare gli antagonisti del TNF, sarà valutato prima di iniziare il farmaco e 6 mesi dopo.

Il consenso informato scritto sarà ottenuto da tutti i pazienti prima di qualsiasi procedura specifica del protocollo e questo studio sarà condotto in conformità con i regolamenti che disciplinano le sperimentazioni cliniche come la Dichiarazione di Helsinki, modificata a Tokyo (2004). Questo studio è stato approvato dal comitato etico di HSM.

Tutte le procedure nelle seguenti attività saranno eseguite in pazienti con RA e AS (siero e sangue) e donatori sani (siero), se non diversamente specificato.

Task 2 - Studio degli stimoli infiammatori e dei marcatori del turnover osseo Sottopopolazioni di cellule del sistema immunitario (neutrofili, sottopopolazioni di cellule B e T, comprese le cellule Th17) saranno analizzate per l'espressione di RANKL di superficie mediante citometria a flusso.

Le citochine pro-infiammatorie come IL-1β, IL-6, IL-17A, IL-20, IL-23, TNF e le proteine ​​modulanti l'osso (OPG, sRANKL, sclerostin e dickkopf-1) saranno quantificate mediante ELISA. Saranno inoltre studiati enzimi di degradazione ossea come la fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP)5b e marcatori di turnover osseo come il telopeptide reticolato carbossiterminale del collagene di tipo I (ICTP) e il propeptide amino-terminale del procollagene di tipo 1 (P1NP).

I dati ottenuti da esperimenti di citometria a flusso e quantificazione delle proteine ​​saranno confrontati tra malattie prima e dopo il trattamento e con donatori sani. Questo ci consentirà di comprendere le differenze specifiche della malattia nell'ambiente infiammatorio sistemico e locale nei pazienti non trattati e l'effetto delle diverse terapie su questo stesso ambiente.

Task 3 - Analisi dei precursori degli osteoclasti e loro differenziazione in osteoclasti funzionali Le cellule CD14+ circolanti saranno caratterizzate analizzando marcatori come HLA-DR, cluster di differenziazione (CD)16, CD86, CD11b e CD62L, nonché proteine ​​associate alla differenziazione degli osteoclasti, come l'integrina di superficie CD51/CD61 (integrina αVβ3), RANK (attivatore del recettore di nf-kappa beta) e il recettore della calcitonina mediante citometria a flusso.

Al fine di caratterizzare completamente i precursori degli osteoclasti, l'espressione di geni correlati agli osteoclasti come DC-STAMP, MITF (fattore di trascrizione associato alla microftalmia), CTSK (catepsina K), TRACP e ATP6v0d2 nelle cellule CD14+ sarà valutata mediante polimerasi quantitativa in tempo reale reazione a catena (RT-qPCR). I risultati ottenuti saranno normalizzati con i geni housekeeping beta glucuronidasi (GUSB) e fosfomannomutasi-1 (PMM1).

I dati ottenuti dalla citometria a flusso e dagli esperimenti di espressione genica saranno confrontati tra pazienti trattati e non trattati e con donatori sani. Questo compito ci fornirà informazioni quantitative sui cambiamenti malattia-specifici della sottopopolazione di monociti CD14+ e ci permetterà di comprendere l'effetto della terapia sulle cellule precursori circolanti.

Task 4 - Funzione e dinamica cellulare degli osteoclasti differenziati I monociti CD14+ isolati saranno coltivati ​​per 21 giorni in presenza di M-CSF (fattore stimolante le colonie di macrofagi) e hrRANKL (attivatore del recettore ricombinante umano del ligando nf-kappa beta) a 37º , 5% CO2 in piastre di coltura multipozzetto.

Gli osteoclasti saranno analizzati ai giorni 7, 14 e 21 della coltura per valutare la dinamica cellulare. L'espressione di geni specifici per gli osteoclasti sarà analizzata a questi punti temporali mediante RT-qPCR (vedi Task 3). L'analisi di citometria a flusso sarà eseguita per valutare l'espressione superficiale di CD51/CD61 e RANK. I dati ottenuti durante i punti temporali (giorni 7, 14 e 21) da pazienti e controlli sani saranno confrontati con gli stessi dati ottenuti dalle cellule precursori.

Al 21° giorno di coltura le cellule saranno utilizzate in due saggi funzionali: colorazione TRAP e saggio di riassorbimento. Nel saggio di colorazione TRAP valuteremo il numero di osteoclasti formati in coltura contando le cellule multinucleate TRAP-positive con più di 3 nuclei (osteoclasti). Il confronto di questo valore con la conta dei nuclei nei monociti CD14+ nelle piastre di coltura ci permetterà di determinare l'indice di fusione di questi precursori. Il saggio di riassorbimento viene effettuato coltivando monociti su fette ossee e ci consente di misurare l'attività di riassorbimento degli osteoclasti funzionali. Questo sarà misurato dall'analisi dell'immagine delle fette ossee colorate con blu di toluidina dove l'area riassorbita acquisisce un colore da blu a viola. L'analisi del tasso di fusione dei precursori e dell'area riassorbita dagli osteoclasti ci permetterà di identificare differenze nella funzione degli osteoclasti tra pazienti affetti da AR e AS e donatori sani.

Sia i monociti che gli osteoclasti saranno studiati per quanto riguarda RANK/RANKL e le vie di segnalazione dell'integrina αVβ3 e c-fms che portano al reclutamento e all'attivazione di TRAF6, tirosina chinasi Src e chinasi extracellulare regolata dal segnale (ERK)1/2 che attiva NF- kB e altri fattori di trascrizione. Queste vie di segnalazione saranno studiate utilizzando la piattaforma Luminex xMAP con EpiQuant Cell Signaling Assays (Millipore). Il confronto dei risultati di pazienti non trattati e controlli ci permetterà di capire se c'è una compromissione delle vie classiche di differenziazione/attivazione degli osteoclasti nell'AS rispetto all'AR.

I risultati ottenuti da pazienti trattati e non trattati forniranno informazioni sull'azione delle terapie sulla differenziazione e funzione degli osteoclasti. Il confronto dei risultati complessivi di pazienti non trattati e donatori sani ci consentirà di comprendere le differenze chiave tra la differenziazione e l'attivazione degli osteoclasti in queste patologie.

Task 5 - Funzione e dinamica cellulare degli osteoblasti In un sottogruppo di pazienti affetti da AR e AS sottoposti a protesi d'anca o chirurgia cervicale verrà studiato il differenziamento degli osteoblasti. Subito dopo l'intervento, dal campione verrà estratto un piccolo frammento di osso trabecolare (1cm3) per isolare gli osteoblasti. Dopo l'isolamento, gli osteoblasti saranno coltivati ​​in terreno minimo essenziale di Dulbecco (DMEM) integrato con vitamina D3 (10-8M) e le cellule saranno studiate all'80% di confluenza. La funzione degli osteoblasti sarà studiata in vitro mediante saggio di metiltiazolo tetrazolio (MTT) (proliferazione cellulare), colorazione con fosfatasi alcalina e formazione di noduli di mineralizzazione. Le cellule saranno utilizzate anche per l'estrazione dell'RNA e l'analisi dell'espressione genica. Geni specifici che codificano per proteine ​​quali osteopontina, collagene di tipo I, osteocalcina, fosfatasi alcalina, RANKL, osteoprotegerina, runx2 e osterix saranno analizzati per caratterizzare le cellule isolate. Questi risultati ci permetteranno di comprendere le differenze nella differenziazione e nell'attività degli osteoblasti tra le malattie.

Task 6 - Saggi di espressione genica ossea In un sottogruppo di pazienti affetti da AR e AS sottoposti a sostituzione dell'anca oa chirurgia cervicale verranno congelati campioni ossei a -80ºC. Con l'osso ancora congelato, un piccolo campione di osso trabecolare sarà ridotto in polvere fine in un mulino criogenico e l'estrazione dell'RNA sarà eseguita utilizzando il reagente TRIzol. L'RNA risultante sarà valutato per la sua integrità e quantificato in un bioanalizzatore. L'RNA estratto sarà quindi la somma degli RNA presenti nell'osso, da sangue, osteoblasti, osteoclasti, osteociti, adipociti e cellule del midollo osseo.

L'espressione genica sia nel microambiente osseo che nelle cellule degli studi in vitro sarà valutata mediante RT-PCR. Geni specifici che codificano proteine ​​sia di osteoblasti che di osteoclasti come osteopontina, collagene di tipo I, osteocalcina, fosfatasi alcalina, RANKL, osteoprotegerina, runx2, osterix, catepsina K, beta3 subunità integrina, recettore della calcitonina, ATPasi subunità d2, TRAF6, RANK, TRAP , saranno studiati, tra gli altri, i co-recettori OSCAR e TREM-2. L'attività degli osteociti sarà inoltre valutata mediante l'espressione di geni specifici, SOST, Dkk1, DMP-1, Phex, antigene E11, MEPE e CD44. Saranno inoltre studiati i geni che codificano le citochine infiammatorie IL-1, IL-6, IL-17 e TNF.

Al fine di valutare l'efficienza della PCR, verranno costruite curve standard dall'RNA estratto da campioni ossei congelati di individui con densità minerale ossea normale e senza altre malattie che potrebbero influenzare il metabolismo osseo. I geni di interesse per osteoclasti, osteoblasti e osteociti saranno quantificati mediante il metodo della curva standard.

Lo studio dell'espressione dell'RNA sui campioni ossei permetterà di comprendere l'attività cellulare locale e di caratterizzare le cellule ossee e la loro funzione in un contesto patologico.