Skillnader i bencellsaktivitet mellan reumatoid artrit och ankyloserande spondylit

Mål:

1. Bedöm påverkan av immunsystemets celler i moduleringen av benomsättning hos patienter med RA, AS och friska donatorer (Uppgift 2).
2. Analysera osteoklastprekursorerna och deras differentiering till fullt fungerande osteoklaster i en undergrupp av patienter med RA, AS och friska donatorer (Uppgift 3, 4 och 6).
3. Studera osteoblastdifferentieringspotential och aktivitet i en undergrupp av patienter med RA och AS (Uppgift 5 och 6)
4. Bedöm effekten av terapin på bencellsdifferentiering och funktion i en undergrupp av patienter med RA och AS som behandlats med TNF-blockerare (Uppgift 2, 3, 4 och 5).

Arbetsprogram och tidtabell Startdatum: juli 2011. Slutdatum: juli 2013 Uppgift 1 - Patienter Patienter med RA-diagnos (enligt de reviderade kriterierna för American Rheumatism Association, 1988) och AS-diagnos (enligt kriterierna för European Spondyloarthropathy Study Group, 1991) följs upp i Rheumatology and Bonease and Metabolic Disease Institutionen för Hospital de Santa Maria (HSM) kommer att rekryteras för denna studie. Tjugofem patienter med aktiv RA (Disease Activity Score 28 (DAS28)>3,2) och 25 patienter med aktiv AS (Bath Ankylosing Spondylit Disease Activity Index (BASDAI)>4) kommer att inkluderas i studien. Femton friska donatorer, kön och ålder matchade, kommer att rekryteras och användas som kontrollgrupp.

Patienterna kommer att underkastas ett kliniskt protokoll som inkluderar information om kön, ålder, sjukdomslängd, tidigare behandlingar, förekomst av reumatoid faktor och anticykliska citrullinerade peptidantikroppar, Human Leukocyte Antigen (HLA)-B27-status, DAS28-poäng och Health Assessment Questionnaire - HAQ (Health Assessment Questionnaire, för RA-patienter), BASDAI, Maastricht Ankyloserande spondylit Enthesitis Score (MASES), Bath Ankylosing Spondylit Functional Index - BASFI (för AS-patienter) och Ankyloserande spondylit Disease Activity Score (ASDAS). Blod kommer att samlas in från patienter innan behandling med glukokortikoider och sjukdomsmodifierande antireumatiska läkemedel (DMARDs: metotrexat, sulfasalazin och leflunomid) påbörjas och 3 månader efter att en stabil dos av dessa läkemedel uppnåtts. För de som senare börjar med TNF-blockerare kommer blodprov att tas efter 6 månader efter påbörjad behandling. Eftersom det förväntas att endast en minoritet av denna initiala kohort kommer att behöva behandlas med TNF-antagonister, kommer en andra grupp av 25 RA- och 25 AS-patienter, utvalda för att starta TNF-antagonister, att utvärderas innan läkemedlet påbörjas och 6 månader senare.

Skriftligt informerat samtycke kommer att erhållas från alla patienter före varje protokollspecifik procedur och denna studie kommer att genomföras i enlighet med bestämmelserna som styr kliniska prövningar såsom Helsingforsdeklarationen, som ändrats i Tokyo (2004). Denna studie godkändes av HSM Ethics Committee.

Alla procedurer i följande uppgifter kommer att utföras på RA- och AS-patienter (serum och blod) och friska donatorer (serum), om inte annat anges.

Uppgift 2 - Studie av inflammatoriska stimuli och benomsättningsmarkörer Subpopulationer av immunsystemceller (neutrofiler, B- och T-cellssubpopulationer, inklusive Th17-celler) kommer att analyseras för yt-RANKL-uttryck genom flödescytometri.

Pro-inflammatoriska cytokiner som IL-1β, IL-6, IL-17A, IL-20, IL-23, TNF och benmodulerande proteiner (OPG, sRANKL, sklerostin och dickkopf-1) kommer att kvantifieras med ELISA. Bennedbrytningsenzymer som tartratresistent surt fosfatas (TRAP)5b och benomsättningsmarkörer som typ I kollagen karboxiterminal tvärbunden telopeptid (ICTP) och prokollagen typ 1 aminoterminal propeptid (P1NP) kommer också att studeras.

Data som erhålls från flödescytometriexperiment och proteinkvantifiering kommer att jämföras mellan sjukdomar före och efter behandling och med friska donatorer. Detta kommer att tillåta oss att förstå de sjukdomsspecifika skillnaderna i den systemiska och lokala inflammatoriska miljön hos obehandlade patienter och effekten av de olika terapierna över samma miljö.

Uppgift 3 - Analys av osteoklastprekursorer och deras differentiering till funktionella osteoklaster Cirkulerande CD14+-celler kommer att karakteriseras genom att analysera markörer som HLA-DR, differentieringskluster (CD)16, CD86, CD11b och CD62L, såväl som osteoklastdifferentieringsassocierade proteiner, såsom ytintegrinet CD51/CD61 (αVβ3-integrin), RANK (receptoraktivator av nf-kappa beta) och kalcitoninreceptorn genom flödescytometri.

För att helt karakterisera osteoklastprekursorerna kommer uttrycket av osteoklastrelaterade gener som DC-STAMP, MITF (mikroftalmiassocierad transkriptionsfaktor), CTSK (cathepsin K), TRACP och ATP6v0d2 i CD14+-celler att bedömas med kvantitativt polymeras i realtid. kedjereaktion (RT-qPCR). De erhållna resultaten kommer att normaliseras med hushållningsgenerna beta glukuronidas (GUSB) och fosfomannomutas-1 (PMM1).

Data erhållna från flödescytometri och genuttrycksexperiment kommer att jämföras mellan behandlade och obehandlade patienter och med friska donatorer. Denna uppgift kommer att ge oss kvantitativ information om de sjukdomsspecifika förändringarna av CD14+ monocyter subpopulationen och det kommer att tillåta oss att förstå effekten av terapi i de cirkulerande prekursorcellerna.

Uppgift 4 - Funktion och celldynamik för de differentierade osteoklasterna. De isolerade CD14+-monocyterna kommer att odlas i 21 dagar i närvaro av M-CSF (makrofagkolonistimulerande faktor) och hrRANKL (human rekombinant receptoraktivator av nf-kappa beta-ligand) vid 37º , 5 % CO2 i odlingsplattor med flera brunnar.

Osteoklaster kommer att analyseras på dag 7, 14 och 21 av odlingen för att bedöma celldynamiken. Uttryck av osteoklastspecifika gener kommer att analyseras vid dessa tidpunkter med RT-qPCR (se uppgift 3). Flödescytometrianalys kommer att utföras för att bedöma CD51/CD61 och RANK ytuttryck. Data erhållna under tidpunkter (dag 7, 14 och 21) från patienter och friska kontroller kommer att jämföras med samma data som erhållits från prekursorcellerna.

Vid den 21:a odlingsdagen kommer celler att användas i två funktionella analyser: TRAP-färgning och resorptionsanalys. I TRAP-färgningsanalysen kommer vi att bedöma antalet osteoklaster som bildas i kultur genom att räkna TRAP-positiva multinukleära celler med mer än 3 kärnor (osteoklaster). Jämförelse av detta värde med kärnantalet i CD14+-monocyter i odlingsplattor kommer att tillåta oss att bestämma fusionsindexet för dessa prekursorer. Resorptionsanalysen utförs genom att odla monocyter över benskivor och låter oss mäta resorptionsaktiviteten hos funktionella osteoklaster. Detta kommer att mätas genom bildanalys av benskivorna färgade med toluidinblått där det resorberade området får en blå till lila färg. Analysen av fusionshastigheten för prekursorer och av det osteoklastresorberade området kommer att tillåta oss att identifiera skillnader i osteoklastfunktion mellan RA- och AS-patienter och friska donatorer.

Både monocyter och osteoklaster kommer att studeras avseende RANK/RANKL och αVβ3 integrin och c-fms signalvägar som leder till rekrytering och aktivering av TRAF6, tyrosinkinas Src och extracellulärt signalreglerat kinas (ERK)1/2 aktiverande NF- kB och andra transkriptionsfaktorer. Dessa signalvägar kommer att studeras med hjälp av Luminex xMAP-plattformen med EpiQuant Cell Signaling Assays (Millipore). Jämförelse av resultaten från obehandlade patienter och kontroller kommer att göra det möjligt för oss att förstå om det finns en försämring av osteoklastdifferentiering/aktivering klassiska vägar i AS jämfört med RA.

Resultaten som erhålls från behandlade och obehandlade patienter kommer att ge insikt om terapiernas verkan på osteoklastdifferentiering och funktion. Genom att jämföra övergripande resultat från obehandlade patienter och friska donatorer kan vi förstå viktiga skillnader mellan osteoklastdifferentiering och aktivering i dessa patologier.

Uppgift 5 - Funktion och celldynamik hos osteoblaster I en undergrupp av RA- och AS-patienter som antingen genomgått höftprotes eller cervikalkirurgi kommer osteoblastdifferentiering att studeras. Omedelbart efter operationen kommer en liten bit trabekulärt ben (1cm3) att extraheras från provet för att isolera osteoblasterna. Efter isolering kommer osteoblaster att odlas i Dulbeccos minimala essentiella medium (DMEM) kompletterat med vitamin D3 (10-8M) och celler kommer att studeras vid 80% konfluens. Osteoblasters funktion kommer att studeras in vitro genom metyltiazoltetrazolium (MTT) analys (cellproliferation), alkalisk fosfatasfärgning och bildning av mineraliseringsknölar. Celler kommer också att användas för RNA-extraktion och genuttrycksanalys Specifika gener som kodar för proteiner såsom osteopontin, kollagen typ I, osteokalcin, alkaliskt fosfatas, RANKL, osteoprotegerin, runx2 och osterix kommer att analyseras för att karakterisera de isolerade cellerna. Dessa resultat kommer att tillåta oss att förstå skillnaderna i osteoblastdifferentiering och aktivitet mellan sjukdomar.

Uppgift 6 - Bengenexpressionsanalyser I en undergrupp av RA- och AS-patienter som antingen genomgår höftprotes eller livmoderhalskirurgi kommer vi att frysa benprover vid -80ºC. Med benet fortfarande fruset kommer ett litet prov av trabekulärt ben att reduceras till fint pulver i en kryogen kvarn och RNA-extraktionen kommer att utföras med TRIzol-reagens. Det resulterande RNA:t kommer att bedömas för dess integritet och kvantifieras i en bioanalysator. Därför kommer det extraherade RNA:t att vara summan av RNA som finns i ben, från blod, osteoblaster, osteoklaster, osteocyter, adipocyter och benmärgsceller.

Genuttrycket både i benmikromiljön och i cellerna från in vitro-studierna kommer att utvärderas med RT-PCR. Specifika gener som kodar för proteiner både från osteoblaster och osteoklaster såsom osteopontin, kollagen typ I, osteokalcin, alkaliskt fosfatas, RANKL, osteoprotegerin, runx2, osterix, cathepsin K, beta3 integrin subenhet, kalcitonin receptor, d2K TRAFapas subunit, ARANKL, TRAF6t , kommer co-receptorerna OSCAR och TREM-2, bland andra, att studeras. Osteocyters aktivitet kommer också att bedömas genom uttryck av specifika gener, SOST, Dkk1, DMP-1, Phex, E11-antigen, MEPE och CD44. De gener som kodar de inflammatoriska cytokinerna IL-1, IL-6, IL-17 och TNF kommer också att studeras.

För att bedöma PCR-effektiviteten kommer standardkurvor att byggas från RNA extraherat från frysta benprover från individer med normal benmineraltäthet och utan någon annan sjukdom som kan påverka benmetabolismen. Osteoklast-, osteoblast- och osteocytgener av intresse kommer att kvantifieras med standardkurvmetoden.

RNA-expressionsstudien på benproverna kommer att göra det möjligt för oss att förstå den lokala cellaktiviteten och den karakteriserar benceller och deras funktion i ett sjukdomssammanhang.