Forskelle i knoglecelleaktivitet mellem reumatoid arthritis og ankyloserende spondylitis

Mål:

1. Vurder indflydelsen af ​​immunsystemceller i moduleringen af ​​knogleomsætning hos patienter med RA, AS og raske donorer (opgave 2).
2. Analyser osteoklastprækursorerne og deres differentiering til fuldt funktionelle osteoklaster i en undergruppe af patienter med RA, AS og raske donorer (opgave 3, 4 og 6).
3. Undersøg osteoblastdifferentieringspotentiale og -aktivitet i en undergruppe af patienter med RA og AS (opgave 5 og 6)
4. Vurder effekten af ​​terapien på knoglecelledifferentiering og funktion i en undergruppe af patienter med RA og AS behandlet med TNF-blokkere (Opgave 2, 3, 4 og 5).

Arbejdsprogram og tidsplan Startdato: juli 2011. Slutdato: juli 2013 Opgave 1 - Patienter Patienter med RA-diagnose (i henhold til de reviderede American Rheumatism Association-kriterier, 1988) og AS-diagnose (i henhold til kriterierne for European Spondyloarthropathy Study Group, 1991) fulgt op i Rheumatology and Bonease and Metabolic Disease Afdelingen for Hospital de Santa Maria (HSM) vil blive rekrutteret til denne undersøgelse. Femogtyve patienter med aktiv RA (Disease Activity Score 28 (DAS28)>3,2) og 25 patienter med aktiv AS (Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index (BASDAI)>4) vil blive inkluderet i undersøgelsen. Femten raske donorer, køn og alder matchede, vil blive rekrutteret og brugt som kontrolgruppe.

Patienterne vil blive underkastet en klinisk protokol, der omfatter information om køn, alder, sygdomsvarighed, tidligere behandlinger, tilstedeværelse af reumatoid faktor og anticyklisk-citrullinerede peptidantistoffer, Human Leukocyte Antigen (HLA)-B27 status, DAS28 score og Health Assessment Questionnaire - HAQ (Health Assessment Questionnaire, for RA-patienter), BASDAI, Maastricht Ankylosing Spondylitis Enthesitis Score (MASES), Bath Ankylosing Spondylitis Functional Index - BASFI (for AS-patienter) og Ankyloserende Spondylitis Disease Activity Score (ASDAS). Blod vil blive opsamlet fra patienter før påbegyndelse af behandling med glukokortikoider og sygdomsmodificerende anti-rheumatiske lægemidler (DMARDs: methotrexat, sulfasalazin og leflunomid) og 3 måneder efter opnåelse af en stabil dosis af disse lægemidler. For de sidstnævnte ved start af TNF-blokkere vil blodprøver blive indsamlet efter 6 måneders start af behandlingen. Fordi det forventes, at kun en minoritet af denne indledende kohorte skal behandles med TNF-antagonister, vil en anden gruppe på 25 RA- og 25 AS-patienter, udvalgt til at starte med TNF-antagonister, blive vurderet før påbegyndelse af lægemidlet og 6 måneder senere.

Der vil blive indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle patienter forud for enhver protokolspecifik procedure, og denne undersøgelse vil blive udført i overensstemmelse med reglerne for kliniske forsøg, såsom Helsinki-erklæringen, som ændret i Tokyo (2004). Denne undersøgelse blev godkendt af HSM Ethics Committee.

Alle procedurerne i de følgende opgaver vil blive udført hos RA- og AS-patienter (serum og blod) og raske donorer (serum), medmindre andet er angivet.

Opgave 2 - Undersøgelse af de inflammatoriske stimuli og knogleomsætningsmarkører Underpopulationer af immunsystemceller (neutrofiler, B- og T-cellesubpopulationer, inklusive Th17-celler) vil blive analyseret for overflade-RANKL-ekspression ved flowcytometri.

Pro-inflammatoriske cytokiner som IL-1β, IL-6, IL-17A, IL-20, IL-23, TNF og knoglemodulerende proteiner (OPG, sRANKL, sclerostin og dickkopf-1) vil blive kvantificeret ved ELISA. Knoglenedbrydningsenzymer som tartrat-resistent sur phosphatase (TRAP)5b og knogleomsætningsmarkører som type I collagen carboxyterminalt tværbundet telopeptid (ICTP) og procollagen type 1 aminoterminalt propeptid (P1NP) vil også blive undersøgt.

Data opnået fra flowcytometri-forsøg og proteinkvantificering vil blive sammenlignet mellem sygdomme før og efter behandling og med raske donorer. Dette vil give os mulighed for at forstå de sygdomsspecifikke forskelle i det systemiske og lokale inflammatoriske miljø hos ubehandlede patienter og effekten af ​​de forskellige terapier over det samme miljø.

Opgave 3 - Analyse af osteoklastprækursorer og deres differentiering til funktionelle osteoklaster Cirkulerende CD14+-celler vil blive karakteriseret ved at analysere markører som HLA-DR, cluster of differentiation (CD)16, CD86, CD11b og CD62L, samt osteoklastdifferentieringsassocierede proteiner, såsom overfladeintegrinet CD51/CD61 (αVβ3 integrin), RANK (receptoraktivator af nf-kappa beta) og calcitoninreceptoren ved flowcytometri.

For fuldt ud at karakterisere osteoklast-prækursorerne, vil ekspressionen af ​​osteoklast-relaterede gener som DC-STAMP, MITF (mikroftalmi-associeret transkriptionsfaktor), CTSK (cathepsin K), TRACP og ATP6v0d2 i CD14+-celler blive vurderet ved real-time kvantitativ polymerase kædereaktion (RT-qPCR). De opnåede resultater vil blive normaliseret med husholdningsgenerne beta glucuronidase (GUSB) og phosphomannomutase-1 (PMM1).

Data opnået fra flowcytometri og genekspressionsforsøg vil blive sammenlignet mellem behandlede og ubehandlede patienter og med raske donorer. Denne opgave vil give os kvantitativ information om de sygdomsspecifikke ændringer af CD14+ monocytter subpopulationen, og den vil give os mulighed for at forstå effekten af ​​terapi i de cirkulerende precursorceller.

Opgave 4 - Funktion og cellulær dynamik af de differentierede osteoklaster De isolerede CD14+ monocytter vil blive dyrket i 21 dage i nærvær af M-CSF (makrofag kolonistimulerende faktor) og hrRANKL (human rekombinant receptor aktivator af nf-kappa beta ligand) ved 37º , 5 % CO2 i flerbrøndskulturplader.

Osteoklaster vil blive analyseret på dag 7, 14 og 21 af kulturen for at vurdere cellulær dynamik. Ekspression af osteoklast-specifikke gener vil blive analyseret på disse tidspunkter ved RT-qPCR (se opgave 3). Flowcytometrianalyse vil blive udført for at vurdere CD51/CD61 og RANK overfladeekspression. Data opnået på tidspunkter (dage 7, 14 og 21) fra patienter og raske kontroller vil blive sammenlignet med de samme data opnået fra precursorcellerne.

På den 21. dyrkningsdag vil celler blive brugt i to funktionelle assays: TRAP-farvning og resorptionsassay. I TRAP-farvningsassayet vil vi vurdere antallet af osteoklaster dannet i kultur ved at tælle TRAP-positive multinukleerede celler med mere end 3 kerner (osteoklaster). Sammenligning af denne værdi med kerneantal i CD14+ monocytter i kulturplader vil tillade os at bestemme fusionsindekset for disse prækursorer. Resorptionsassayet udføres ved at dyrke monocytter over knogleskiver og giver os mulighed for at måle resorptionsaktiviteten af ​​funktionelle osteoklaster. Dette vil blive målt ved billedanalyse af knogleskiverne farvet med toluidin-blå, hvor det resorberede område får en blå til lilla farve. Analysen af ​​fusionshastigheden af ​​prækursorer og af det osteoklastresorberede område vil give os mulighed for at identificere forskelle i osteoklastfunktion mellem RA- og AS-patienter og raske donorer.

Både monocytter og osteoklaster vil blive undersøgt med hensyn til RANK/RANKL og αVβ3 integrin og c-fms signalvejene, der fører til rekruttering og aktivering af TRAF6, tyrosinkinase Src og ekstracellulær signalreguleret kinase (ERK)1/2 aktiverende NF- kB og andre transkriptionsfaktorer. Disse signalveje vil blive undersøgt ved hjælp af Luminex xMAP platformen med EpiQuant Cell Signaling Assays (Millipore). Sammenligning af resultaterne fra ubehandlede patienter og kontroller vil give os mulighed for at forstå, om der er en svækkelse af osteoklastdifferentiering/aktivering klassiske veje i AS sammenlignet med RA.

Resultaterne opnået fra behandlede og ubehandlede patienter vil give indsigt i terapiernes virkning på osteoklastdifferentiering og funktion. Sammenligning af overordnede resultater fra ubehandlede patienter og raske donorer vil give os mulighed for at forstå vigtige forskelle mellem osteoklastdifferentiering og aktivering i disse patologier.

Opgave 5 - Funktion og cellulær dynamik af osteoblaster I en undergruppe af RA- og AS-patienter, der enten har gennemgået hofteudskiftning eller cervikal kirurgi, vil osteoblastdifferentiering blive undersøgt. Umiddelbart efter operationen vil et lille stykke trabekulær knogle (1 cm3) blive ekstraheret fra prøven for at isolere osteoblasterne. Efter isolering vil osteoblaster blive dyrket i Dulbeccos minimale essentielle medium (DMEM) suppleret med vitamin D3 (10-8M), og celler vil blive undersøgt ved 80% konfluens. Osteoblasters funktion vil blive undersøgt in vitro ved methylthiazoltetrazolium (MTT) assay (celleproliferation), alkalisk phosphatase-farvning og dannelse af mineraliseringsknuder. Celler vil også blive brugt til RNA-ekstraktion og genekspressionsanalyse. Specifikke gener, der koder for proteiner såsom osteopontin, collagen type I, osteocalcin, alkalisk phosphatase, RANKL, osteoprotegerin, runx2 og osterix vil blive analyseret for at karakterisere de isolerede celler. Disse resultater vil give os mulighed for at forstå forskellene i osteoblastdifferentiering og aktivitet mellem sygdomme.

Opgave 6 - Knoglegenekspressionsassays I en undergruppe af RA- og AS-patienter, der enten gennemgår hofteudskiftning eller cervikal kirurgi, vil vi nedfryse knogleprøver ved -80ºC. Med knoglen stadig frosset, vil en lille prøve af trabekulær knogle blive reduceret til fint pulver i en kryogen mølle, og RNA-ekstraktion vil blive udført ved hjælp af TRIzol-reagens. Det resulterende RNA vil blive vurderet for dets integritet og kvantificeret i en bioanalysator. Derfor vil det ekstraherede RNA være den samlede mængde RNA, der er til stede i knogle, fra blod, osteoblaster, osteoklaster, osteocytter, adipocytter og knoglemarvsceller.

Genekspressionen både i knoglemikromiljøet og i cellerne fra in vitro undersøgelserne vil blive evalueret ved RT-PCR. Specifikke gener, der koder for proteiner både fra osteoblaster og osteoklaster, såsom osteopontin, kollagen type I, osteocalcin, alkalisk fosfatase, RANKL, osteoprotegerin, runx2, osterix, cathepsin K, beta3 integrin underenhed, calcitonin receptor, d2K TRAF6t, d2K TRAF6t , vil co-receptorerne blandt andet OSCAR og TREM-2 blive undersøgt. Osteocytters aktivitet vil også blive vurderet ved ekspression af specifikke gener, SOST, Dkk1, DMP-1, Phex, E11 antigen, MEPE og CD44. De gener, der koder for de inflammatoriske cytokiner IL-1, IL-6, IL-17 og TNF, vil også blive undersøgt.

For at vurdere PCR-effektiviteten vil der blive bygget standardkurver ud fra RNA ekstraheret fra frosne knogleprøver fra individer med normal knoglemineraltæthed og uden anden sygdom, der kan have indflydelse på knoglemetabolismen. Osteoklast-, osteoblast- og osteocytgenerne af interesse vil blive kvantificeret ved standardkurvemetoden.

RNA-ekspressionsundersøgelsen på knogleprøverne vil give os mulighed for at forstå den lokale celleaktivitet, og den karakteriserer knogleceller og deres funktion i en sygdomssammenhæng.