Különbségek a csontsejtek aktivitásában a rheumatoid arthritis és a spondylitis ankylopoetica között

Célok:

1. Értékelje az immunrendszer sejtjeinek hatását a csontturnover modulációjában RA-ban, AS-ben és egészséges donorokban (2. feladat).
2. Elemezze az osteoclast prekurzorokat és differenciálódását teljesen működőképes oszteoklasztokká RA-ban, AS-ben és egészséges donorokban szenvedő betegek egy alcsoportjában (3., 4. és 6. feladat).
3. Az oszteoblasztok differenciálódási potenciáljának és aktivitásának vizsgálata RA-ban és AS-ben szenvedő betegek egy alcsoportjában (5. és 6. feladat)
4. Értékelje a terápia hatását a csontsejtek differenciálódására és funkciójára az RA-ban és AS-ban szenvedő betegek egy alcsoportjában, akiket TNF-blokkolóval kezeltek (2., 3., 4. és 5. feladat).

Munkaprogram és ütemterv Kezdés időpontja: 2011. július. Befejezés dátuma: 2013. július 1. feladat – RA diagnózisú betegek (az American Rheumatism Association felülvizsgált kritériumai szerint, 1988) és AS diagnózisban (az Európai Spondyloarthropathy Study Group kritériumai szerint, 1991) a Reumatology and Boneas and Metabolikus csoportban nyomon követve A Kórház de Santa Maria (HSM) osztályát toborozzák ebbe a tanulmányba. Huszonöt aktív RA-ban szenvedő beteget (28 (DAS28) >3,2) és 25 aktív AS-ban szenvedő beteget (BASDAI betegség aktivitási indexe (BASDAI) >4) vonnak be a vizsgálatba. Tizenöt egészséges donort vesznek fel, akiknek nemük és koruk megegyezik, és kontrollcsoportként használják őket.

A betegeket klinikai protokollnak vetik alá, amely információkat tartalmaz a nemről, életkorról, a betegség időtartamáról, a korábbi kezelésekről, a rheumatoid faktor és az anticiklikus citrullinált peptid antitestek jelenlétéről, a humán leukocita antigén (HLA)-B27 státuszáról, a DAS28 pontszámról és az állapotfelmérő kérdőívről. - HAQ (Health Assessment Questionnaire, RA betegek számára), BASDAI, Maastricht Spondylitis ankylopoetica Enthesitis Score (MASES), Bath Spondylitis ankylopoetica Functional Index - BASFI (AS betegek számára) és Spondylitis ankylopoetica Disease Activity Score (ASDAS). A glükokortikoidokkal és a betegséget módosító reumaellenes gyógyszerekkel (DMARD-ok: metotrexát, szulfaszalazin és leflunomid) végzett kezelés megkezdése előtt, valamint 3 hónappal azután, hogy e gyógyszerek stabil dózisát elérik, vért vesznek. Az utóbbiaknál a TNF-blokkolók megkezdésekor vérmintát vesznek a terápia megkezdése után 6 hónappal. Mivel várhatóan ennek a kezdeti kohorsznak csak egy kisebb részét kell TNF-antagonistákkal kezelni, a második, 25 RA-s és 25 AS-s betegcsoportot, akiket a TNF-antagonisták kezdetére választottak ki, a gyógyszer megkezdése előtt és 6 hónappal később értékelnek.

Minden betegtől írásos beleegyező nyilatkozatot kell beszerezni a protokoll-specifikus eljárás előtt, és ezt a vizsgálatot a klinikai vizsgálatokra vonatkozó előírásoknak, például a Tokióban (2004) módosított Helsinki Nyilatkozatnak megfelelően kell lefolytatni. Ezt a tanulmányt a HSM Etikai Bizottsága hagyta jóvá.

Az alábbi feladatokban szereplő összes eljárást RA és AS betegeknél (szérum és vér) és egészséges donoroknál (szérum) hajtják végre, hacsak nincs másképp jelezve.

2. feladat – A gyulladásos ingerek és a csontturnover markerek vizsgálata Az immunrendszer sejtjeinek szubpopulációit (neutrofilek, B- és T-sejt alpopulációk, beleértve a Th17 sejteket is) áramlási citometriával elemezzük a felszíni RANKL expresszió szempontjából.

A gyulladást elősegítő citokineket, mint az IL-1β, IL-6, IL-17A, IL-20, IL-23, TNF és a csontmoduláló fehérjéket (OPG, sRANKL, sclerostin és dickkopf-1) ELISA-val kell meghatározni. A csontlebontó enzimeket, például a tartarát-rezisztens savas foszfatázt (TRAP)5b és a csontforgalom markereit, mint az I. típusú kollagén karboxiterminális keresztkötéses telopeptid (ICTP) és az 1-es típusú prokollagén amino-terminális propeptid (P1NP) is tanulmányozni fogják.

Az áramlási citometriás kísérletekből és a fehérje mennyiségi meghatározásából nyert adatokat összehasonlítják a kezelés előtti és utáni betegségek között, valamint egészséges donorokkal. Ez lehetővé teszi számunkra, hogy megértsük a kezeletlen betegek szisztémás és lokális gyulladásos környezetének betegségspecifikus különbségeit, valamint a különböző terápiák hatását ugyanarra a környezetre.

3. feladat – Az oszteoklaszt prekurzorok elemzése és funkcionális oszteoklasztokká történő differenciálódása A keringő CD14+ sejteket olyan markerek, mint a HLA-DR, a differenciálódási klaszter (CD)16, CD86, CD11b és CD62L, valamint az oszteoklaszt differenciálódáshoz kapcsolódó fehérjék elemzésével jellemezzük, mint például a felszíni integrin CD51/CD61 (αVβ3 integrin), RANK (az nf-kappa béta receptor aktivátora) és a kalcitonin receptor áramlási citometriával.

Az oszteoklaszt prekurzorok teljes körű jellemzése érdekében valós idejű kvantitatív polimerázzal értékeljük az oszteoklasztokkal kapcsolatos gének, mint például a DC-STAMP, MITF (mikroftalmia-asszociált transzkripciós faktor), CTSK (katepszin K), TRACP és ATP6v0d2 expresszióját CD14+ sejtekben. láncreakció (RT-qPCR). A kapott eredményeket a béta-glükuronidáz (GUSB) és a foszfomannomutáz-1 (PMM1) housekeeping génekkel normalizáljuk.

Az áramlási citometriás és génexpressziós kísérletekből nyert adatokat a kezelt és a kezeletlen betegek, valamint az egészséges donorok között összehasonlítják. Ez a feladat kvantitatív információt nyújt a CD14+ monocita szubpopuláció betegség-specifikus változásairól, és lehetővé teszi számunkra, hogy megértsük a terápia hatását a keringő prekurzor sejtekben.

4. feladat – A differenciálódott oszteoklasztok működése és sejtdinamikája Az izolált CD14+ monocitákat 21 napig tenyésztjük M-CSF (macrophag colony stimulating factor) és hrRANKL (humán rekombináns nf-kappa béta ligandum receptor aktivátor) jelenlétében 37º-on. , 5% CO2 többüregű tenyésztőlemezeken.

Az oszteoklasztokat a tenyésztés 7., 14. és 21. napján elemzik a sejtdinamika értékelésére. Az oszteoklaszt-specifikus gének expresszióját ezekben az időpontokban RT-qPCR-rel elemezzük (lásd 3. feladat). Áramlási citometriás analízist végzünk a CD51/CD61 és a RANK felszíni expressziójának értékelésére. A betegektől és egészséges kontrolloktól az időpontokban (7., 14. és 21. nap) nyert adatokat összehasonlítjuk a prekurzor sejtekből kapott adatokkal.

A 21. tenyésztési napon a sejteket két funkcionális vizsgálatban használjuk fel: TRAP festésben és reszorpciós vizsgálatban. A TRAP festési vizsgálatban a tenyészetben képződött oszteoklasztok számát úgy értékeljük, hogy megszámoljuk a 3-nál több magot tartalmazó TRAP-pozitív többmagvú sejteket (oszteoklasztokat). Ennek az értéknek a tenyésztőlemezeken lévő CD14+ monociták sejtmagszámával való összehasonlítása lehetővé teszi ezen prekurzorok fúziós indexének meghatározását. A reszorpciós vizsgálatot monociták csontszeleteken történő tenyésztésével hajtják végre, és lehetővé teszi a funkcionális oszteoklasztok reszorpciós aktivitásának mérését. Ezt a toluidin-kékkel festett csontszeletek képanalízisével mérik, ahol a felszívódott terület kéktől liláig terjed. A prekurzorok és az oszteoklaszt felszívódási terület fúziós sebességének elemzése lehetővé teszi számunkra, hogy azonosítsuk az oszteoklasztok működésében mutatkozó különbségeket RA és AS betegek és egészséges donorok között.

Mind a monocitákat, mind az oszteoklasztokat tanulmányozni fogják a RANK/RANKL, valamint az αVβ3 integrin és c-fms jelátviteli útvonalak tekintetében, amelyek a TRAF6, a tirozin kináz Src és az extracelluláris szignál-szabályozott kináz (ERK)1/2 aktiváló NF- toborzásához és aktiválásához vezetnek. kB és egyéb transzkripciós faktorok. Ezeket a jelátviteli útvonalakat a Luminex xMAP platform és az EpiQuant Cell Signaling Assays (Millipore) segítségével tanulmányozzuk. A kezeletlen betegek és a kontrollok eredményeinek összehasonlítása lehetővé teszi számunkra, hogy megértsük, van-e károsodás az osteoclast differenciálódási/aktivációs klasszikus útvonalakban AS-ben az RA-hoz képest.

A kezelt és nem kezelt betegektől kapott eredmények betekintést nyújtanak a terápiák osteoclast differenciálódásra és funkcióra gyakorolt ​​hatásába. A kezeletlen betegek és az egészséges donorok általános eredményeinek összehasonlítása lehetővé teszi számunkra, hogy megértsük az oszteoklasztok differenciálódása és aktiválódása közötti kulcsfontosságú különbségeket ezekben a patológiákban.

5. feladat – Az oszteoblasztok funkciója és sejtdinamikája Az RA és AS betegek egy alcsoportjában, akik csípőprotézisre vagy nyaki műtétre kerültek, az oszteoblasztok differenciálódását vizsgálják. Közvetlenül a műtét után egy kis darab trabekuláris csontot (1 cm3) vonnak ki a mintából az oszteoblasztok izolálására. Az izolálást követően az oszteoblasztokat Dulbecco minimális esszenciális tápközegében (DMEM) tenyésztjük, amelyet D3-vitaminnal (10-8M) egészítenek ki, és a sejteket 80%-os konfluencián vizsgálják. Az oszteoblasztok működését in vitro metiltiazol-tetrazolium (MTT) vizsgálattal (sejtproliferáció), alkalikus foszfatáz festéssel és mineralizációs csomók képződésével vizsgáljuk. A sejteket RNS extrakcióhoz és génexpressziós analízishez is felhasználják. Az izolált sejtek jellemzésére olyan specifikus géneket elemeznek, amelyek olyan fehérjéket kódolnak, mint az oszteopontin, az I-es típusú kollagén, az oszteokalcin, az alkalikus foszfatáz, a RANKL, az oszteoprotegerin, a runx2 és az osterix. Ezek az eredmények lehetővé teszik számunkra, hogy megértsük az oszteoblasztok differenciálódásában és aktivitásában mutatkozó különbségeket a betegségek között.

6. feladat - Csont génexpressziós vizsgálatok Csípőprotézis vagy méhnyak műtéten átesett RA és AS betegek egy alcsoportjában csontmintákat fagyasztunk le -80ºC-on. Amikor a csont még lefagyott, egy kis trabekuláris csontmintát finom porrá redukálnak egy kriogén malomban, és az RNS extrakciót TRIzol reagenssel végezzük. A kapott RNS sértetlenségét értékeljük, és egy bioanalizátorban mennyiségileg meghatározzuk. Ezért a kivont RNS a csontban, vérből, oszteoblasztokból, oszteoklasztokból, oszteocitákból, zsírsejtekből és csontvelősejtekből származó összes RNS lesz.

A génexpressziót mind a csont mikrokörnyezetében, mind az in vitro vizsgálatokból származó sejtekben RT-PCR-rel értékeljük. Specifikus gének, amelyek mind az oszteoblasztokból, mind az oszteoklasztokból származó fehérjéket kódolnak, mint például az oszteopontin, I-es típusú kollagén, oszteokalcin, alkalikus foszfatáz, RANKL, osteoprotegerin, runx2, osterix, katepszin K, béta3 integrin alegység, kalcitonin receptor, ATPáz alegység d2 TRAP TRAP , többek között az OSCAR és a TREM-2 társreceptorokat vizsgálják. Az oszteociták aktivitását specifikus gének, SOST, Dkk1, DMP-1, Phex, E11 antigén, MEPE és CD44 expressziójával is értékelni fogják. Az IL-1, IL-6, IL-17 és TNF gyulladásos citokineket kódoló géneket is tanulmányozni fogják.

A PCR hatékonyságának felmérése érdekében a normál csontsűrűségű, a csontanyagcserét befolyásoló betegségben nem szenvedő egyének fagyasztott csontmintáiból kinyert RNS-ből standard görbéket készítünk. Az érdeklődésre számot tartó oszteoklaszt, oszteoblaszt és oszteocita géneket a standard görbe módszerrel számszerűsítjük.

A csontmintákon végzett RNS expressziós vizsgálat lehetővé teszi a helyi sejtaktivitás megértését, valamint a csontsejtek és azok funkciójának jellemzését a betegség összefüggésében.