Rozdíly v aktivitě kostních buněk mezi revmatoidní artritidou a ankylozující spondylitidou

Cíle:

1. Posuďte vliv buněk imunitního systému na modulaci kostního obratu u pacientů s RA, AS a zdravých dárců (Úkol 2).
2. Analyzujte prekurzory osteoklastů a jejich diferenciaci na plně funkční osteoklasty u podskupiny pacientů s RA, AS a zdravých dárců (Úkol 3, 4 a 6).
3. Studujte diferenciační potenciál a aktivitu osteoblastů u podskupiny pacientů s RA a AS (Úloha 5 a 6)
4. Posuďte vliv terapie na diferenciaci a funkci kostních buněk u podskupiny pacientů s RA a AS léčených TNF-blokátory (Úkol 2, 3, 4 a 5).

Pracovní program a harmonogram Termín zahájení: červenec 2011. Termín dokončení: červenec 2013 Úkol 1 - Pacienti Pacienti s diagnózou RA (podle revidovaných kritérií American Rheumatism Association, 1988) a diagnózou AS (podle kritérií European Spondyloartropathy Study Group, 1991) sledováni v Revmatologii a kostních a metabolických onemocněních Pro tuto studii bude přijato oddělení Hospital de Santa Maria (HSM). Do studie bude zahrnuto 25 pacientů s aktivní RA (Disease Activity Score 28 (DAS28)>3,2) a 25 pacientů s aktivní AS (Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index (BASDAI)>4). Patnáct zdravých dárců, pohlaví a věku, bude přijato a použito jako kontrolní skupina.

Pacienti budou podrobeni klinickému protokolu, který obsahuje informace o pohlaví, věku, trvání onemocnění, předchozích terapiích, přítomnosti revmatoidního faktoru a protilátek proti cyklickému citrulinovanému peptidu, stavu lidského leukocytárního antigenu (HLA)-B27, skóre DAS28 a dotazníku hodnocení zdraví - HAQ (Health Assessment Questionnaire, pro pacienty s RA), BASDAI, Maastrichtské skóre entezitidy ankylozující spondylitidy (MASES), funkční index vanové ankylozující spondylitidy - BASFI (pro pacienty s AS) a skóre aktivity ankylozující spondylitidy (ASDAS). Krev bude pacientům odebírána před zahájením léčby glukokortikoidy a chorobu modifikujícími antirevmatiky (DMARDs: metotrexát, sulfasalazin a leflunomid) a 3 měsíce po dosažení stabilní dávky těchto léků. Těm, kteří při zahájení léčby blokují TNF, budou odebírány vzorky krve po 6 měsících od zahájení léčby. Protože se očekává, že pouze menšina této počáteční kohorty bude muset být léčena antagonisty TNF, bude druhá skupina 25 pacientů s RA a 25 pacientů s AS, vybraných pro zahájení podávání antagonistů TNF, hodnocena před zahájením léčby a o 6 měsíců později.

Před jakýmkoli postupem specifickým pro protokol bude od všech pacientů získán písemný informovaný souhlas a tato studie bude provedena v souladu s předpisy upravujícími klinické zkoušky, jako je Helsinská deklarace ve znění pozdějších předpisů v Tokiu (2004). Tato studie byla schválena Etickou komisí HSM.

Všechny postupy v následujících úlohách budou prováděny u pacientů s RA a AS (sérum a krev) a zdravých dárců (sérum), pokud není uvedeno jinak.

Úkol 2 - Studium zánětlivých stimulů a markerů kostního obratu Subpopulace buněk imunitního systému (neutrofily, subpopulace B a T buněk, včetně buněk Th17) budou analyzovány na povrchovou expresi RANKL pomocí průtokové cytometrie.

Prozánětlivé cytokiny jako IL-lp, IL-6, IL-17A, IL-20, IL-23, TNF a kostní modulační proteiny (OPG, sRANKL, sklerostin a dickkopf-1) budou kvantifikovány pomocí ELISA. Budou také studovány enzymy degradace kostí jako tartrát-rezistentní kyselá fosfatáza (TRAP)5b a markery kostního obratu jako kolagenový karboxyterminální zesítěný telopeptid typu I (ICTP) a prokolagen typu 1 aminoterminální propeptid (P1NP).

Data získaná z experimentů průtokové cytometrie a kvantifikace proteinů budou porovnána mezi onemocněními před a po léčbě a se zdravými dárci. To nám umožní porozumět rozdílům specifickým pro onemocnění v systémovém a lokálním zánětlivém prostředí u neléčených pacientů a vlivu různých terapií na stejné prostředí.

Úkol 3 – Analýza prekurzorů osteoklastů a jejich diferenciace na funkční osteoklasty Cirkulující buňky CD14+ budou charakterizovány analýzou markerů, jako je HLA-DR, shluk diferenciace (CD)16, CD86, CD11b a CD62L, stejně jako proteiny spojené s diferenciací osteoklastů, jako je povrchový integrin CD51/CD61 (integrin aVp3), RANK (aktivátor receptoru nf-kappa beta) a kalcitoninový receptor průtokovou cytometrií.

Aby bylo možné plně charakterizovat prekurzory osteoklastů, exprese genů souvisejících s osteoklasty, jako je DC-STAMP, MITF (microphthalmia-associated transcription factor), CTSK (kathepsin K), TRACP a ATP6v0d2 v buňkách CD14+, bude hodnocena kvantitativní polymerázou v reálném čase. řetězová reakce (RT-qPCR). Získané výsledky budou normalizovány pomocí provozních genů beta glukuronidázy (GUSB) a fosfomanomutázy-1 (PMM1).

Data získaná z průtokové cytometrie a experimentů s genovou expresí budou porovnána mezi léčenými a neléčenými pacienty a se zdravými dárci. Tento úkol nám poskytne kvantitativní informace o chorobně specifických změnách subpopulace CD14+ monocytů a umožní nám porozumět účinku terapie v cirkulujících prekurzorových buňkách.

Úkol 4 - Funkce a buněčná dynamika diferencovaných osteoklastů Izolované CD14+ monocyty budou kultivovány po dobu 21 dnů v přítomnosti M-CSF (faktor stimulující kolonie makrofágů) a hrRANKL (aktivátor lidského rekombinantního receptoru nf-kappa beta ligandu) při 37º , 5% CO2 ve vícejamkových kultivačních destičkách.

Osteoklasty budou analyzovány 7., 14. a 21. den kultivace za účelem posouzení buněčné dynamiky. Exprese genů specifických pro osteoklasty bude v těchto časových bodech analyzována pomocí RT-qPCR (viz úkol 3). Pro posouzení povrchové exprese CD51/CD61 a RANK bude provedena analýza průtokovou cytometrií. Data získaná během časových bodů (7., 14. a 21. den) od pacientů a zdravých kontrol budou porovnána se stejnými daty získanými z prekurzorových buněk.

Ve 21. kultivačním dni budou buňky použity ve dvou funkčních testech: barvení TRAP a test resorpce. V testu barvení TRAP budeme hodnotit počet osteoklastů vytvořených v kultuře počítáním TRAP-pozitivních vícejaderných buněk s více než 3 jádry (osteoklasty). Porovnání této hodnoty s počtem jader v CD14+ monocytech v kultivačních miskách nám umožní určit fúzní index těchto prekurzorů. Resorpční test se provádí kultivací monocytů na kostních řezech a umožňuje nám měřit resorpční aktivitu funkčních osteoklastů. To bude měřeno obrazovou analýzou kostních plátků obarvených toluidinovou modří, kde resorbovaná oblast získává modrou až fialovou barvu. Analýza rychlosti fúze prekurzorů a plochy resorbované osteoklasty nám umožní identifikovat rozdíly ve funkci osteoklastů mezi pacienty s RA a AS a zdravými dárci.

Monocyty i osteoklasty budou studovány s ohledem na signální dráhy RANK/RANKL a integrinu αVβ3 a c-fms, které vedou k náboru a aktivaci TRAF6, tyrosinkinázy Src a kinázy regulované extracelulárním signálem (ERK)1/2 aktivující NF- kB a další transkripční faktory. Tyto signální dráhy budou studovány pomocí platformy Luminex xMAP s EpiQuant Cell Signaling Assays (Millipore). Srovnání výsledků od neléčených pacientů a kontrol nám umožní pochopit, zda dochází k poškození klasických drah diferenciace/aktivace osteoklastů u AS ve srovnání s RA.

Výsledky získané od léčených a neléčených pacientů poskytnou pohled na působení terapií na diferenciaci a funkci osteoklastů. Porovnání celkových výsledků od neléčených pacientů a zdravých dárců nám umožní pochopit klíčové rozdíly mezi diferenciací a aktivací osteoklastů u těchto patologií.

Úkol 5 - Funkce a buněčná dynamika osteoblastů V podskupině pacientů s RA a AS podstoupených buď náhradou kyčelního kloubu nebo cervikální chirurgií bude studována diferenciace osteoblastů. Ihned po operaci bude ze vzorku extrahován malý kousek trabekulární kosti (1 cm3), aby se izolovaly osteoblasty. Po izolaci budou osteoblasty kultivovány v Dulbeccově minimálním esenciálním médiu (DMEM) doplněném vitaminem D3 (10-8M) a buňky budou studovány při 80% konfluenci. Funkce osteoblastů bude studována in vitro testem methylthiazoltetrazolium (MTT) (proliferace buněk), barvením alkalickou fosfatázou a tvorbou mineralizačních nodulů. Buňky budou také použity pro extrakci RNA a analýzu genové exprese Pro charakterizaci izolovaných buněk budou analyzovány specifické geny, které kódují proteiny jako osteopontin, kolagen typu I, osteokalcin, alkalická fosfatáza, RANKL, osteoprotegerin, runx2 a osterix. Tyto výsledky nám umožní pochopit rozdíly v diferenciaci a aktivitě osteoblastů mezi onemocněními.

Úkol 6 – Testy exprese kostního genu U podskupiny pacientů s RA a AS podrobených buď náhradě kyčelního kloubu nebo cervikální operaci zmrazíme vzorky kostí při -80ºC. Když je kost stále zmrazená, malý vzorek trabekulární kosti se rozmělní na jemný prášek v kryogenním mlýnu a extrakce RNA se provede pomocí činidla TRIzol. Výsledná RNA bude hodnocena z hlediska její integrity a kvantifikována v bioanalyzátoru. Proto bude extrahovaná RNA celková RNA přítomná v kosti, z krve, osteoblastů, osteoklastů, osteocytů, adipocytů a buněk kostní dřeně.

Genová exprese jak v kostním mikroprostředí, tak v buňkách ze studií in vitro bude hodnocena pomocí RT-PCR. Specifické geny, které kódují proteiny z osteoblastů i osteoklastů, jako je osteopontin, kolagen typu I, osteokalcin, alkalická fosfatáza, RANKL, osteoprotegerin, runx2, osterix, katepsin K, beta3 integrinová podjednotka, kalcitoninový receptor, ATPázová podjednotka d2, TRAF6, RANK, TRAP , budou studovány mimo jiné koreceptory OSCAR a TREM-2. Aktivita osteocytů bude také hodnocena pomocí exprese specifických genů, SOST, Dkk1, DMP-1, Phex, E11 antigenu, MEPE a CD44. Budou také studovány geny, které kódují zánětlivé cytokiny IL-1, IL-6, IL-17 a TNF.

Za účelem posouzení účinnosti PCR budou vytvořeny standardní křivky z RNA extrahované ze zmrazených vzorků kostí od jedinců s normální hustotou kostních minerálů a bez jiného onemocnění, které by mohlo ovlivnit kostní metabolismus. Požadované geny osteoklastů, osteoblastů a osteocytů budou kvantifikovány metodou standardní křivky.

Studie exprese RNA na vzorcích kostí nám umožní porozumět místní buněčné aktivitě a charakterizovat kostní buňky a jejich funkci v kontextu onemocnění.