Różnice w aktywności komórek kostnych między reumatoidalnym zapaleniem stawów a zesztywniającym zapaleniem stawów kręgosłupa

Cele:

1. Ocena wpływu komórek układu odpornościowego na modulację obrotu kostnego u pacjentów z RZS, ZZSK oraz zdrowych dawców (Zadanie 2).
2. Przeanalizuj prekursory osteoklastów i ich różnicowanie do w pełni funkcjonalnych osteoklastów w podgrupie pacjentów z RZS, ZA i zdrowych dawców (Zadanie 3, 4 i 6).
3. Badanie potencjału różnicowania i aktywności osteoblastów w podgrupie pacjentów z RZS i ZZSK (Zadanie 5 i 6)
4. Ocenić wpływ terapii na różnicowanie i funkcję komórek kostnych w podgrupie pacjentów z RZS i ZZSK leczonych blokerami TNF (Zadanie 2, 3, 4 i 5).

Program prac i harmonogram Termin rozpoczęcia: lipiec 2011 r. Termin zakończenia: lipiec 2013 Zadanie 1 - Pacjenci Pacjenci z rozpoznaniem RZS (według poprawionych kryteriów American Rheumatism Association, 1988) i ZZSK (według kryteriów European Spondyloarthroopathy Study Group, 1991) obserwowani w Reumatology and Bone and Metabolic Diseases Do tego badania zostanie zatrudniony Department of Hospital de Santa Maria (HSM). Do badania zostanie włączonych dwudziestu pięciu pacjentów z aktywnym RZS (wskaźnik aktywności choroby 28 (DAS28)>3,2) i 25 pacjentów z aktywnym ZA (wskaźnik aktywności choroby zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa w kąpieli (BASDAI)>4). Piętnastu zdrowych dawców, dobranych pod względem płci i wieku, zostanie zrekrutowanych i wykorzystanych jako grupa kontrolna.

Pacjenci zostaną poddani protokołowi klinicznemu, który zawiera informacje na temat płci, wieku, czasu trwania choroby, wcześniejszych terapii, obecności czynnika reumatoidalnego i przeciwciał przeciw cyklicznie cytrulinowanym peptydom, statusu ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA)-B27, wyniku DAS28 i kwestionariusza oceny stanu zdrowia - HAQ (Kwestionariusz oceny stanu zdrowia, dla pacjentów z RZS), BASDAI, Maastricht Zesztywniające Zapalenie Kręgosłupa Enthesitis Score (MASES), Kąpielowy Indeks Czynności Zesztywniającego Zapalenia Kręgosłupa - BASFI (dla pacjentów z ZA) i Zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa (ASDAS). Krew od pacjentów będzie pobierana przed rozpoczęciem leczenia glikokortykosteroidami i lekami przeciwreumatycznymi modyfikującymi przebieg choroby (LMPCh: metotreksat, sulfasalazyna i leflunomid) oraz 3 miesiące po osiągnięciu stabilnej dawki tych leków. W przypadku osób, które rozpoczynają terapię blokerami TNF próbki krwi zostaną pobrane po 6 miesiącach od rozpoczęcia terapii. Ponieważ oczekuje się, że tylko mniejszość z tej początkowej kohorty będzie wymagać leczenia antagonistami TNF, druga grupa 25 pacjentów z RZS i 25 AS, wybranych do początkowego leczenia antagonistami TNF, zostanie oceniona przed rozpoczęciem leczenia i 6 miesięcy później.

Pisemna świadoma zgoda zostanie uzyskana od wszystkich pacjentów przed jakąkolwiek procedurą określoną w protokole, a badanie to zostanie przeprowadzone zgodnie z przepisami regulującymi badania kliniczne, takimi jak Deklaracja Helsińska, zmieniona w Tokio (2004). Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki HSM.

Wszystkie procedury w poniższych zadaniach będą wykonywane u pacjentów z RZS i ZA (surowica i krew) oraz zdrowych dawców (surowica), chyba że zaznaczono inaczej.

Zadanie 2 - Badanie bodźców zapalnych i markerów obrotu kostnego Subpopulacje komórek układu odpornościowego (neutrofile, subpopulacje limfocytów B i T, w tym limfocyty Th17) zostaną poddane analizie pod kątem ekspresji powierzchniowej RANKL metodą cytometrii przepływowej.

Cytokiny prozapalne, takie jak IL-1β, IL-6, IL-17A, IL-20, IL-23, TNF i białka modulujące kość (OPG, sRANKL, sklerostyna i dickkopf-1) zostaną oznaczone metodą ELISA. Zbadane zostaną również enzymy degradujące kości, takie jak kwaśna fosfataza winianowata (TRAP)5b i markery obrotu kostnego, takie jak karboksyterminalny usieciowany telopeptyd (ICTP) kolagenu typu I i propeptyd prokolagenu typu 1 na końcu aminowym (P1NP).

Dane uzyskane z eksperymentów z cytometrią przepływową i oznaczania ilościowego białek zostaną porównane między chorobami przed i po leczeniu oraz ze zdrowymi dawcami. Pozwoli nam to zrozumieć specyficzne dla choroby różnice w ogólnoustrojowym i miejscowym środowisku zapalnym u nieleczonych pacjentów oraz wpływ różnych terapii na to samo środowisko.

Zadanie 3 - Analiza prekursorów osteoklastów i ich różnicowanie w funkcjonalne osteoklasty Krążące komórki CD14+ zostaną scharakteryzowane poprzez analizę markerów takich jak HLA-DR, klastry różnicowania (CD)16, CD86, CD11b i CD62L, a także białek związanych z różnicowaniem osteoklastów, takie jak integryna powierzchniowa CD51/CD61 (integryna αVβ3), RANK (aktywator receptora nf-kappa beta) i receptor kalcytoniny za pomocą cytometrii przepływowej.

Aby w pełni scharakteryzować prekursory osteoklastów, ekspresja genów związanych z osteoklastami, takich jak DC-STAMP, MITF (czynnik transkrypcyjny związany z mikroftalmią), CTSK (katepsyna K), TRACP i ATP6v0d2 w komórkach CD14+ zostanie oceniona za pomocą ilościowej polimerazy w czasie rzeczywistym reakcja łańcuchowa (RT-qPCR). Uzyskane wyniki zostaną znormalizowane za pomocą genów metabolizmu podstawowego beta-glukuronidazy (GUSB) i fosfomanomutazy-1 (PMM1).

Dane uzyskane z cytometrii przepływowej i eksperymentów z ekspresją genów zostaną porównane między leczonymi i nieleczonymi pacjentami oraz ze zdrowymi dawcami. Zadanie to dostarczy nam ilościowych informacji na temat specyficznych dla choroby zmian subpopulacji monocytów CD14+ oraz pozwoli zrozumieć efekt terapii w krążących komórkach prekursorowych.

Zadanie 4 - Funkcja i dynamika komórkowa zróżnicowanych osteoklastów Wyizolowane monocyty CD14+ będą hodowane przez 21 dni w obecności M-CSF (czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów) i hrRANKL (aktywator ludzkiego rekombinowanego receptora ligandu nf-kappa beta) w temperaturze 37º , 5% CO2 w wielodołkowych płytkach hodowlanych.

Osteoklasty będą analizowane w dniach 7, 14 i 21 hodowli w celu oceny dynamiki komórkowej. Ekspresja genów specyficznych dla osteoklastów będzie analizowana w tych punktach czasowych za pomocą RT-qPCR (patrz Zadanie 3). Przeprowadzona zostanie analiza metodą cytometrii przepływowej w celu oceny ekspresji powierzchniowej CD51/CD61 i RANK. Dane uzyskane w punktach czasowych (dni 7, 14 i 21) od pacjentów i zdrowych kontroli zostaną porównane z tymi samymi danymi uzyskanymi z komórek prekursorowych.

W 21. dniu hodowli komórki zostaną użyte w dwóch testach funkcjonalnych: barwienie TRAP i test resorpcji. W teście barwienia TRAP ocenimy liczbę utworzonych w hodowli osteoklastów poprzez zliczenie TRAP-dodatnich komórek wielojądrzastych z więcej niż 3 jądrami (osteoklasty). Porównanie tej wartości z liczbą jąder w monocytach CD14+ na płytkach hodowlanych pozwoli określić wskaźnik fuzji tych prekursorów. Test resorpcji przeprowadza się przez hodowanie monocytów na skrawkach kości i pozwala nam zmierzyć aktywność resorpcyjną funkcjonalnych osteoklastów. Zostanie to zmierzone za pomocą analizy obrazu skrawków kości wybarwionych błękitem toluidynowym, gdzie wchłonięty obszar przybiera kolor od niebieskiego do fioletowego. Analiza szybkości fuzji prekursorów i obszaru resorpcji osteoklastów pozwoli nam zidentyfikować różnice w funkcji osteoklastów między pacjentami z RZS i ZZSK a zdrowymi dawcami.

Zarówno monocyty, jak i osteoklasty będą badane pod kątem szlaków sygnałowych integryny RANK/RANKL i αVβ3 oraz c-fms, które prowadzą do rekrutacji i aktywacji TRAF6, kinazy tyrozynowej Src i kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK)1/2 aktywującej NF- kB i inne czynniki transkrypcyjne. Te szlaki sygnalizacyjne będą badane przy użyciu platformy Luminex xMAP z testami EpiQuant Cell Signaling Assays (Millipore). Porównanie wyników uzyskanych od pacjentów nieleczonych i kontrolnych pozwoli nam zrozumieć, czy w ZA w porównaniu z RZS występuje upośledzenie klasycznych szlaków różnicowania/aktywacji osteoklastów.

Wyniki uzyskane od pacjentów leczonych i nieleczonych zapewnią wgląd w wpływ terapii na różnicowanie i funkcję osteoklastów. Porównanie ogólnych wyników uzyskanych od nieleczonych pacjentów i zdrowych dawców pozwoli nam zrozumieć kluczowe różnice między różnicowaniem a aktywacją osteoklastów w tych patologiach.

Zadanie 5 - Funkcja i dynamika komórkowa osteoblastów W podgrupie pacjentów z RZS i ZZSK poddanych zabiegowi endoprotezoplastyki stawu biodrowego lub operacji szyjki macicy, zbadane zostanie różnicowanie osteoblastów. Bezpośrednio po zabiegu z próbki zostanie pobrany mały fragment kości beleczkowej (1 cm3) w celu wyizolowania osteoblastów. Po wyizolowaniu osteoblasty będą hodowane w pożywce Dulbecco o minimalnej zawartości składników odżywczych (DMEM) uzupełnionej witaminą D3 (10-8 M) i komórki będą badane przy 80% konfluencji. Funkcja osteoblastów będzie badana in vitro za pomocą testu metylotiazolo-tetrazoliowego (MTT) (proliferacja komórek), barwienia fosfatazą alkaliczną i tworzenia guzków mineralizacyjnych. Komórki zostaną również wykorzystane do ekstrakcji RNA i analizy ekspresji genów. Specyficzne geny kodujące białka, takie jak osteopontyna, kolagen typu I, osteokalcyna, fosfataza alkaliczna, RANKL, osteoprotegeryna, runx2 i osterix zostaną przeanalizowane w celu scharakteryzowania wyizolowanych komórek. Wyniki te pozwolą nam zrozumieć różnice w różnicowaniu i aktywności osteoblastów między chorobami.

Zadanie 6 - Testy ekspresji genów kości W podgrupie pacjentów z RZS i AS poddanych operacji wymiany stawu biodrowego lub szyjki macicy zamrożymy próbki kości w temperaturze -80ºC. Gdy kość jest nadal zamrożona, mała próbka kości beleczkowej zostanie rozdrobniona na drobny proszek w młynie kriogenicznym, a ekstrakcja RNA zostanie przeprowadzona przy użyciu odczynnika TRIzol. Powstały RNA zostanie oceniony pod kątem integralności i zmierzony ilościowo w bioanalizatorze. Dlatego wyekstrahowany RNA będzie całkowitym RNA obecnym w kości, z krwi, osteoblastów, osteoklastów, osteocytów, adipocytów i komórek szpiku kostnego.

Ekspresja genów zarówno w mikrośrodowisku kości, jak iw komórkach z badań in vitro zostanie oceniona metodą RT-PCR. Specyficzne geny kodujące białka zarówno z osteoblastów, jak i osteoklastów, takie jak osteopontyna, kolagen typu I, osteokalcyna, fosfataza alkaliczna, RANKL, osteoprotegeryna, runx2, osterix, katepsyna K, podjednostka integryny beta3, receptor kalcytoniny, podjednostka ATPazy d2, TRAF6, RANK, TRAP , badane będą m.in. koreceptory OSCAR i TREM-2. Aktywność osteocytów będzie również oceniana na podstawie ekspresji określonych genów, SOST, Dkk1, DMP-1, Phex, antygenu E11, MEPE i CD44. Zbadane zostaną również geny kodujące cytokiny zapalne IL-1, IL-6, IL-17 i TNF.

W celu oceny skuteczności PCR zostaną zbudowane krzywe wzorcowe z RNA wyekstrahowanego z zamrożonych próbek kości od osób z prawidłową gęstością mineralną kości i bez innych chorób mogących mieć wpływ na metabolizm kostny. Geny osteoklastów, osteoblastów i osteocytów będące przedmiotem zainteresowania zostaną określone ilościowo metodą krzywej standardowej.

Badanie ekspresji RNA na próbkach kości pozwoli nam zrozumieć lokalną aktywność komórek i scharakteryzować komórki kości oraz ich funkcję w kontekście chorobowym.