류마티스 관절염과 강직성 척추염의 뼈 세포 활동의 차이

목표:

1. RA, AS 및 건강한 공여자가 있는 환자의 골교체 조절에서 면역계 세포의 영향을 평가합니다(작업 2).
2. RA, AS 및 건강한 공여자가 있는 환자의 하위 그룹에서 파골 세포 전구체 및 완전한 기능 파골 세포로의 분화를 분석합니다(작업 3, 4 및 6).
3. RA 및 AS 환자의 하위 그룹에서 조골 세포 분화 잠재력 및 활성 연구(작업 5 및 6)
4. TNF-차단제로 치료받은 RA 및 AS 환자의 하위 그룹에서 골 세포 분화 및 기능에 대한 요법의 효과를 평가합니다(작업 2, 3, 4 및 5).

작업 프로그램 및 시간표 시작 날짜: 2011년 7월. 완료 날짜: 2013년 7월 작업 1 - 환자 RA 진단(개정된 미국 류머티즘 협회 기준, 1988에 따름) 및 AS 진단(유럽 척추관절병증 연구 그룹 기준, 1991에 따름)이 있는 환자는 류마티스 및 뼈 및 대사 질환에서 후속 조치를 취했습니다. HSM(Hospital de Santa Maria) 부서가 이 연구를 위해 모집될 것입니다. 활동성 RA(Disease Activity Score 28(DAS28)>3.2) 환자 25명과 활동성 AS(Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index(BASDAI)>4) 환자 25명이 연구에 포함될 예정입니다. 성별과 연령이 일치하는 15명의 건강한 기증자를 모집하여 대조군으로 사용할 것입니다.

환자는 성별, 연령, 질병 기간, 이전 치료, 류마티스 인자 및 항순환 시트룰린화 펩타이드 항체의 존재, 인간 백혈구 항원(HLA)-B27 상태, DAS28 점수 및 건강 평가 설문지에 대한 정보를 포함하는 임상 프로토콜에 제출됩니다. - HAQ(건강 평가 설문지, RA 환자용), BASDAI, Maastricht 강직성 척추염 골부착부염 점수(MASES), 목욕 강직성 척추염 기능 지수 - BASFI(AS 환자용) 및 강직성 척추염 질병 활동 점수(ASDAS). 글루코코르티코이드 및 질병 수정 항류마티스제(DMARD: 메토트렉세이트, 설파살라진 및 레플루노마이드)로 치료를 시작하기 전과 이러한 약물의 안정적인 용량에 도달한 후 3개월 동안 환자로부터 혈액을 채취합니다. TNF-차단제를 시작한 환자의 경우 혈액 샘플은 치료 시작 6개월 후에 수집됩니다. 이 초기 코호트의 소수만이 TNF 길항제로 치료를 받아야 할 것으로 예상되기 때문에, TNF 길항제를 시작하기 위해 선택된 25명의 RA 및 25명의 AS 환자로 구성된 두 번째 그룹은 약물을 시작하기 전과 6개월 후에 평가될 것입니다.

프로토콜별 절차에 앞서 모든 환자로부터 사전 서면 동의를 얻을 것이며, 이 연구는 도쿄(2004)에서 개정된 헬싱키 선언과 같은 임상 시험을 관장하는 규정에 따라 수행될 것입니다. 이 연구는 HSM 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.

다음 작업의 모든 절차는 달리 명시되지 않는 한 RA 및 AS 환자(혈청 및 혈액)와 건강한 기증자(혈청)에서 수행됩니다.

작업 2 - 염증 자극 및 뼈 전환 마커 연구 면역계 세포의 하위 집단(Th17 세포를 포함하는 호중구, B 및 T 세포 하위 집단)은 유동 세포측정법에 의해 표면 RANKL 발현에 대해 분석됩니다.

IL-1β, IL-6, IL-17A, IL-20, IL-23, TNF 및 골 조절 단백질(OPG, sRANKL, 스클레로스틴 및 딕코프-1)과 같은 전 염증성 사이토카인은 ELISA로 정량화됩니다. Tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP)5b와 같은 뼈 분해 효소와 Type I 콜라겐 carboxyterminal cross-linked telopeptide(ICTP) 및 procollagen type 1 amino-terminal propeptide(P1NP)와 같은 뼈 교체 마커도 연구될 것입니다.

유세포 분석 실험과 단백질 정량화를 통해 얻은 데이터는 치료 전후의 질병과 건강한 기증자를 비교합니다. 이를 통해 치료받지 않은 환자의 전신 및 국소 염증 환경의 질병별 차이와 동일한 환경에 대한 다양한 치료법의 효과를 이해할 수 있습니다.

작업 3 - 파골 세포 전구체 분석 및 기능적 파골 세포로의 분화 순환하는 CD14+ 세포는 파골 세포 분화 관련 단백질뿐만 아니라 HLA-DR, 분화 클러스터(CD)16, CD86, CD11b 및 CD62L과 같은 마커를 분석하여 특성화됩니다. 표면 인테그린 CD51/CD61(αVβ3 인테그린), RANK(nf-kappa 베타의 수용체 활성제) 및 유세포 분석에 의한 칼시토닌 수용체와 같은.

파골 세포 전구체를 완전히 특성화하기 위해 CD14+ 세포에서 DC-STAMP, MITF(소안구증 관련 전사 인자), CTSK(카텝신 K), TRACP 및 ATP6v0d2와 같은 파골 세포 관련 유전자의 발현을 실시간 정량 중합효소로 평가합니다. 연쇄 반응(RT-qPCR). 얻은 결과는 하우스키핑 유전자 베타 글루쿠로니다아제(GUSB) 및 포스포만노뮤타아제-1(PMM1)로 정규화됩니다.

유세포 분석 및 유전자 발현 실험에서 얻은 데이터는 치료를 받은 환자와 치료를 받지 않은 환자 간에 그리고 건강한 기증자와 비교됩니다. 이 작업은 CD14+ 단핵구 하위 집단의 질병 특이적 변화에 대한 정량적 정보를 제공하고 순환하는 전구 세포에서 치료 효과를 이해할 수 있게 해줍니다.

작업 4 - 분화된 파골세포의 기능 및 세포 역학 분리된 CD14+ 단핵구는 M-CSF(대식세포 콜로니 자극 인자) 및 hrRANKL(nf-카파 베타 리간드의 인간 재조합 수용체 활성제)의 존재 하에 37º에서 21일 동안 배양됩니다. , 멀티웰 배양 플레이트에서 5% CO2.

파골 세포는 세포 역학을 평가하기 위해 배양 7, 14 및 21일에 분석됩니다. 파골 세포 특이적 유전자의 발현은 RT-qPCR에 의해 이러한 시점에서 분석됩니다(작업 3 참조). CD51/CD61 및 RANK 표면 발현을 평가하기 위해 유세포 분석을 수행할 것입니다. 환자 및 건강한 대조군으로부터 시점(7일, 14일 및 21일) 동안 얻은 데이터를 전구체 세포로부터 얻은 동일한 데이터와 비교할 것이다.

21번째 배양일에 세포는 TRAP 염색 및 흡수 분석의 두 가지 기능 분석에 사용됩니다. TRAP 염색 분석에서 우리는 3개 이상의 핵(파골 세포)을 가진 TRAP 양성 다핵 세포를 계수하여 배양에서 형성된 파골 세포의 수를 평가할 것입니다. 배양 플레이트에서 CD14+ 단핵구의 핵 수와 이 값을 비교하면 이러한 전구체의 융합 지수를 결정할 수 있습니다. 재흡수 분석은 뼈 조각 위에 단핵구를 배양하여 수행되며 기능성 파골 세포의 재흡수 활동을 측정할 수 있습니다. 이것은 재흡수된 영역이 파란색에서 보라색을 획득하는 톨루이딘-블루로 염색된 뼈 조각의 이미지 분석으로 측정됩니다. 전구체의 융합 속도와 파골 세포 재흡수 영역의 분석을 통해 RA 및 AS 환자와 건강한 기증자 사이의 파골 세포 기능의 차이를 식별할 수 있습니다.

단핵구와 파골세포 모두 RANK/RANKL, αVβ3 인테그린 및 TRAF6, 티로신 키나아제 Src 및 세포외 신호 조절 키나아제(ERK) 1/2 활성화 NF kB 및 기타 전사 인자. 이러한 신호 경로는 EpiQuant Cell Signaling Assays(Millipore)와 함께 Luminex xMAP 플랫폼을 사용하여 연구됩니다. 치료되지 않은 환자와 대조군의 결과를 비교하면 RA와 비교하여 AS에서 파골 세포 분화/활성화 고전적 경로에 장애가 있는지 이해할 수 있습니다.

치료된 환자와 치료되지 않은 환자로부터 얻은 결과는 파골 세포 분화 및 기능에 대한 치료법의 작용에 대한 통찰력을 제공할 것입니다. 치료받지 않은 환자와 건강한 기증자의 전체 결과를 비교하면 이러한 병리학에서 파골 세포 분화와 활성화 사이의 주요 차이점을 이해할 수 있습니다.

작업 5 - 조골세포의 기능 및 세포 역학 고관절 치환술 또는 자궁경부 수술을 받은 RA 및 AS 환자의 하위 그룹에서 조골세포 분화가 연구될 것입니다. 수술 직후 조골 세포를 분리하기 위해 작은 소주골 조각(1cm3)을 샘플에서 추출합니다. 분리 후 조골세포는 비타민D3(10-8M)가 보충된 Dulbecco 최소 필수 배지(DMEM)에서 배양되고 세포는 80% 합류점에서 연구됩니다. 조골세포의 기능은 MTT(methylthiazole tetrazolium) 분석(세포 증식), 알칼리 포스파타제 염색 및 광물화 결절 형성에 의해 시험관 내에서 연구될 것입니다. 세포는 또한 RNA 추출 및 유전자 발현 분석에 사용될 것입니다. 오스테오폰틴, 콜라겐 유형 I, 오스테오칼신, 알칼리 포스파타제, RANKL, 오스테오프로테게린, runx2 및 오스테릭스와 같은 단백질을 암호화하는 특정 유전자를 분석하여 분리된 세포를 특성화합니다. 이러한 결과를 통해 질병 간 골아세포 분화 및 활동의 차이를 이해할 수 있습니다.

작업 6 - 뼈 유전자 발현 분석 고관절 치환술 또는 자궁경부 수술을 받은 RA 및 AS 환자의 하위 그룹에서 뼈 샘플을 -80ºC에서 동결합니다. 뼈가 여전히 동결된 상태에서 소주골의 작은 샘플이 극저온 분쇄기에서 미세 분말로 감소되고 RNA 추출이 TRIzol 시약을 사용하여 수행됩니다. 생성된 RNA는 무결성에 대해 평가되고 Bioanalyser에서 정량화됩니다. 따라서 추출되는 RNA는 혈액, 조골세포, 파골세포, 골세포, 지방세포, 골수세포 등 뼈에 존재하는 RNA의 총합이 됩니다.

골 미세환경 및 체외 연구로부터의 세포에서의 유전자 발현은 RT-PCR에 의해 평가될 것이다. 오스테오폰틴, 콜라겐 I형, 오스테오칼신, 알칼리성 포스파타제, RANKL, 오스테오프로테게린, runx2, 오스테릭스, 카텝신 K, 베타3 인테그린 서브유닛, 칼시토닌 수용체, ATPase 서브유닛 d2, TRAF6, RANK, TRAP와 같은 조골세포 및 파골세포의 단백질을 암호화하는 특정 유전자 , 공동 수용체 OSCAR 및 TREM-2가 연구될 것입니다. 골세포의 활성은 또한 특정 유전자, SOST, Dkk1, DMP-1, Phex, E11 항원, MEPE 및 CD44의 발현에 의해 평가될 것입니다. 염증성 사이토카인 IL-1, IL-6, IL-17 및 TNF를 코딩하는 유전자도 연구될 것입니다.

PCR 효율을 평가하기 위해 골밀도가 정상이고 골 대사에 영향을 미칠 수 있는 다른 질병이 없는 개인의 냉동 뼈 샘플에서 추출한 RNA로부터 표준 곡선을 만들 것입니다. 파골 세포, 조골 세포 및 관심 골 세포 유전자는 표준 곡선 방법으로 정량화됩니다.

뼈 샘플에 대한 RNA 발현 연구를 통해 국소 세포 활동을 이해할 수 있으며 질병 상황에서 뼈 세포와 그 기능을 특성화할 수 있습니다.