Forskjeller i beincelleaktivitet mellom revmatoid artritt og ankyloserende spondylitt

Mål:

1. Vurder påvirkningen av immunsystemceller i moduleringen av beinomsetning hos pasienter med RA, AS og friske donorer (Oppgave 2).
2. Analyser osteoklastforløperne og deres differensiering til fullt funksjonelle osteoklaster i en undergruppe av pasienter med RA, AS og friske donorer (oppgave 3, 4 og 6).
3. Studer osteoblastdifferensieringspotensial og aktivitet i en undergruppe av pasienter med RA og AS (oppgave 5 og 6)
4. Vurder effekten av terapien på bencelledifferensiering og funksjon i en undergruppe av pasienter med RA og AS behandlet med TNF-blokkere (Oppgave 2, 3, 4 og 5).

Arbeidsprogram og timeplan Startdato: juli 2011. Sluttdato: juli 2013 Oppgave 1 - Pasienter Pasienter med RA-diagnose (i henhold til de reviderte American Rheumatism Association-kriteriene, 1988) og AS-diagnose (i henhold til European Spondyloarthropathy Study Group criteria, 1991) fulgt opp i Rheumatology and Bonease and Metabolic Disease Institutt for Hospital de Santa Maria (HSM) vil bli rekruttert til denne studien. 25 pasienter med aktiv RA (Disease Activity Score 28 (DAS28)>3,2) og 25 pasienter med aktiv AS (Bath Ankylosing Spondylitt Disease Activity Index (BASDAI)>4) vil bli inkludert i studien. Femten friske givere, kjønn og alder matchet, vil bli rekruttert og brukt som kontrollgruppe.

Pasienter vil bli underkastet en klinisk protokoll som inkluderer informasjon om kjønn, alder, sykdomsvarighet, tidligere terapier, tilstedeværelse av revmatoidfaktor og antisyklisk-citrullinerte peptidantistoffer, Human Leukocyte Antigen (HLA)-B27-status, DAS28-score og Health Assessment Questionnaire - HAQ (Health Assessment Questionnaire, for RA-pasienter), BASDAI, Maastricht Ankyloserende Spondylitt Enthesitis Score (MASES), Bath Ankylosing Spondylitt Functional Index - BASFI (for AS-pasienter) og Bekhterevs sykdom (ASDAS). Blod vil bli tatt fra pasienter før behandling med glukokortikoider og sykdomsmodifiserende antirevmatiske legemidler (DMARDs: metotreksat, sulfasalazin og leflunomid) startes og 3 måneder etter oppnådd stabil dose av disse legemidlene. For de sistnevnte ved oppstart av TNF-blokkere vil blodprøver bli tatt etter 6 måneder etter behandlingsstart. Fordi det forventes at bare et mindretall av denne første kohorten må behandles med TNF-antagonister, vil en andre gruppe på 25 RA- og 25 AS-pasienter, valgt for å starte med TNF-antagonister, bli vurdert før oppstart av stoffet og 6 måneder senere.

Skriftlig informert samtykke vil bli innhentet fra alle pasienter før enhver protokollspesifikk prosedyre, og denne studien vil bli utført i samsvar med regelverket som regulerer kliniske studier, slik som Helsinki-erklæringen, som endret i Tokyo (2004). Denne studien ble godkjent av HSM Ethics Committee.

Alle prosedyrene i følgende oppgaver vil bli utført hos RA- og AS-pasienter (serum og blod) og friske givere (serum), med mindre annet er oppgitt.

Oppgave 2 - Studie av inflammatoriske stimuli og benomsetningsmarkører Underpopulasjoner av immunsystemceller (nøytrofiler, B- og T-cellesubpopulasjoner, inkludert Th17-celler) vil bli analysert for overflate-RANKL-ekspresjon ved flowcytometri.

Pro-inflammatoriske cytokiner som IL-1β, IL-6, IL-17A, IL-20, IL-23, TNF og benmodulerende proteiner (OPG, sRANKL, sklerostin og dickkopf-1) vil bli kvantifisert ved ELISA. Bennedbrytningsenzymer som tartrat-resistent sur fosfatase (TRAP)5b og benomsetningsmarkører som type I kollagen karboksyterminalt kryssbundet telopeptid (ICTP) og prokollagen type 1 aminoterminalt propeptid (P1NP) vil også bli studert.

Dataene innhentet fra flowcytometri-eksperimenter og proteinkvantifisering vil bli sammenlignet mellom sykdommer før og etter behandling og med friske givere. Dette vil tillate oss å forstå de sykdomsspesifikke forskjellene i det systemiske og lokale inflammatoriske miljøet hos ubehandlede pasienter og effekten av de forskjellige terapiene over det samme miljøet.

Oppgave 3 - Analyse av osteoklastforløpere og deres differensiering til funksjonelle osteoklaster. Sirkulerende CD14+-celler vil bli karakterisert ved å analysere markører som HLA-DR, cluster of differentiation (CD)16, CD86, CD11b og CD62L, samt osteoklastdifferensieringsassosierte proteiner, slik som overflateintegrinet CD51/CD61 (αVβ3 integrin), RANK (reseptoraktivator av nf-kappa beta) og kalsitoninreseptoren ved flowcytometri.

For å fullt ut karakterisere osteoklastforløperne, vil uttrykket av osteoklastrelaterte gener som DC-STAMP, MITF (mikroftalmiassosiert transkripsjonsfaktor), CTSK (cathepsin K), TRACP og ATP6v0d2 i CD14+-celler bli vurdert ved hjelp av sanntids kvantitativ polymerase kjedereaksjon (RT-qPCR). Resultatene som oppnås vil bli normalisert med husholdningsgenene beta glukuronidase (GUSB) og fosfomannomutase-1 (PMM1).

Data hentet fra flowcytometri og genekspresjonsforsøk vil bli sammenlignet mellom behandlede og ubehandlede pasienter og med friske givere. Denne oppgaven vil gi oss kvantitativ informasjon om de sykdomsspesifikke endringene i CD14+ monocytter subpopulasjonen, og den vil tillate oss å forstå effekten av terapi i de sirkulerende forløpercellene.

Oppgave 4 - Funksjon og cellulær dynamikk til de differensierte osteoklastene De isolerte CD14+-monocyttene vil bli dyrket i 21 dager i nærvær av M-CSF (makrofagkolonistimulerende faktor) og hrRANKL (human rekombinant reseptoraktivator av nf-kappa beta-ligand) ved 37º , 5 % CO2 i kulturplater med flere brønner.

Osteoklaster vil bli analysert på dag 7, 14 og 21 av kultur for å vurdere cellulær dynamikk. Ekspresjon av osteoklastspesifikke gener vil bli analysert på disse tidspunktene ved RT-qPCR (se Oppgave 3). Flowcytometrianalyse vil bli utført for å vurdere CD51/CD61 og RANK overflateuttrykk. Data innhentet i løpet av tidspunktene (dag 7, 14 og 21) fra pasienter og friske kontroller vil bli sammenlignet med de samme dataene innhentet fra forløpercellene.

På den 21. kulturdagen vil celler bli brukt i to funksjonelle analyser: TRAP-farging og resorpsjonsanalyse. I TRAP-fargeanalysen vil vi vurdere antall osteoklaster dannet i kultur ved å telle TRAP-positive multinukleerte celler med mer enn 3 kjerner (osteoklaster). Sammenligning av denne verdien med antall kjerner i CD14+ monocytter i kulturplater vil tillate oss å bestemme fusjonsindeksen til disse forløperne. Resorpsjonsanalysen utføres ved å dyrke monocytter over benskiver og lar oss måle resorpsjonsaktiviteten til funksjonelle osteoklaster. Dette vil bli målt ved bildeanalyse av benskivene farget med toluidin-blått hvor det resorberte området får en blå til lilla farge. Analysen av fusjonshastigheten til forløpere og av det osteoklastresorberte området vil tillate oss å identifisere forskjeller i osteoklastfunksjon mellom RA- og AS-pasienter og friske donorer.

Både monocytter og osteoklaster vil bli studert angående RANK/RANKL og αVβ3 integrin og c-fms signalveier som fører til rekruttering og aktivering av TRAF6, tyrosinkinase Src og ekstracellulær signalregulert kinase (ERK)1/2 aktiverende NF- kB og andre transkripsjonsfaktorer. Disse signalveiene vil bli studert ved å bruke Luminex xMAP-plattformen med EpiQuant Cell Signaling Assays (Millipore). Sammenligning av resultatene fra ubehandlede pasienter og kontroller vil tillate oss å forstå om det er en svekkelse i osteoklastdifferensiering/aktivering klassiske veier i AS sammenlignet med RA.

Resultatene oppnådd fra behandlede og ubehandlede pasienter vil gi innsikt i terapienes virkning på osteoklastdifferensiering og funksjon. Sammenligning av generelle resultater fra ubehandlede pasienter og friske givere vil tillate oss å forstå viktige forskjeller mellom osteoklastdifferensiering og aktivering i disse patologiene.

Oppgave 5 - Funksjon og cellulær dynamikk til osteoblaster I en undergruppe av RA og AS pasienter som enten gjennomgår hofteprotese eller cervikal kirurgi vil osteoblastdifferensiering bli studert. Umiddelbart etter operasjonen vil et lite stykke trabekulært ben (1cm3) trekkes ut fra prøven for å isolere osteoblastene. Etter isolering vil osteoblaster bli dyrket i Dulbeccos minimale essensielle medium (DMEM) supplert med vitamin D3 (10-8M) og celler vil bli studert ved 80 % konfluens. Osteoblasters funksjon vil bli studert in vitro ved metyltiazoltetrazolium (MTT)-analyse (celleproliferasjon), alkalisk fosfatasefarging og dannelse av mineraliseringsknuter. Celler vil også bli brukt til RNA-ekstraksjon og genekspresjonsanalyse Spesifikke gener som koder for proteiner som osteopontin, kollagen type I, osteocalcin, alkalisk fosfatase, RANKL, osteoprotegerin, runx2 og osterix vil bli analysert for å karakterisere de isolerte cellene. Disse resultatene vil tillate oss å forstå forskjellene i osteoblastdifferensiering og aktivitet mellom sykdommer.

Oppgave 6 - Bengenekspresjonsanalyser I en undergruppe av RA- og AS-pasienter som enten gjennomgår hofteprotese eller livmorhalskirurgi, vil vi fryse beinprøver ved -80ºC. Med benet fortsatt frosset, vil en liten prøve av trabekulært bein reduseres til fint pulver i en kryogen mølle og RNA-ekstraksjonen vil bli utført ved bruk av TRIzol-reagens. Det resulterende RNA vil bli vurdert for sin integritet og kvantifisert i en bioanalysator. Derfor vil RNA som ekstraheres være totalen av RNA som er tilstede i bein, fra blod, osteoblaster, osteoklaster, osteocytter, adipocytter og benmargsceller.

Genuttrykket både i beinmikromiljøet og i cellene fra in vitro-studiene vil bli evaluert ved RT-PCR. Spesifikke gener som koder for proteiner både fra osteoblaster og osteoklaster som osteopontin, kollagen type I, osteokalsin, alkalisk fosfatase, RANKL, osteoprotegerin, runx2, osterix, cathepsin K, beta3 integrin underenhet, kalsitoninreseptor, d2K TRAFunit, ARAN, TRAF6t , vil co-reseptorene OSCAR og TREM-2, blant andre, bli studert. Osteocyttenes aktivitet vil også bli vurdert ved ekspresjon av spesifikke gener, SOST, Dkk1, DMP-1, Phex, E11 antigen, MEPE og CD44. Genene som koder for de inflammatoriske cytokinene IL-1, IL-6, IL-17 og TNF vil også bli studert.

For å vurdere PCR-effektiviteten vil det bygges standardkurver fra RNA ekstrahert fra frosne benprøver fra individer med normal benmineraltetthet og uten annen sykdom som kan ha innflytelse på benmetabolismen. Osteoklast-, osteoblast- og osteocytegenene av interesse vil kvantifiseres ved standardkurvemetoden.

RNA-ekspresjonsstudien på beinprøvene vil tillate oss å forstå den lokale celleaktiviteten og den karakteriserer beinceller og deres funksjon i en sykdomssammenheng.