Diferenças na atividade das células ósseas entre artrite reumatóide e espondilite anquilosante

Objetivos.

1. Avaliar a influência das células do sistema imunológico na modulação do turnover ósseo em pacientes com AR, EA e doadores saudáveis ​​(Tarefa 2).
2. Analisar os precursores de osteoclastos e sua diferenciação em osteoclastos totalmente funcionais em um subgrupo de pacientes com AR, AS e doadores saudáveis ​​(Tarefa 3, 4 e 6).
3. Estudar o potencial de diferenciação osteoblástica e a atividade em um subgrupo de pacientes com AR e AS (Tarefas 5 e 6)
4. Avalie o efeito da terapia na diferenciação e função das células ósseas em um subgrupo de pacientes com AR e EA tratados com bloqueadores de TNF (Tarefas 2, 3, 4 e 5).

Programa de trabalho e calendário Data de início: julho de 2011. Data de término: julho de 2013 Tarefa 1 - Pacientes Pacientes com diagnóstico de AR (de acordo com os critérios revisados ​​da American Rheumatism Association, 1988) e diagnóstico de AS (de acordo com os critérios do European Spondyloarthropathy Study Group, 1991) acompanhados no Rheumatology and Bone and Metabolic Diseases O Departamento do Hospital de Santa Maria (HSM) será recrutado para este estudo. Vinte e cinco pacientes com AR ativa (Disease Activity Score 28 (DAS28)>3,2) e 25 pacientes com EA ativa (Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index (BASDAI)>4) serão incluídos no estudo. Quinze doadores saudáveis, pareados por sexo e idade, serão recrutados e usados ​​como grupo controle.

Os pacientes serão submetidos a um protocolo clínico que inclui informações sobre sexo, idade, duração da doença, terapias anteriores, presença de fator reumatoide e anticorpos antipeptídeos citrulinados cíclicos, status do antígeno leucocitário humano (HLA)-B27, escore DAS28 e questionário de avaliação de saúde - HAQ (Questionário de Avaliação de Saúde, para pacientes com AR), BASDAI, Maastricht Ankylosing Spondylitis Enthesitis Score (MASES), Bath Ankylosing Spondylitis Functional Index - BASFI (para pacientes com EA) e Ankylosing Spondylitis Disease Activity Score (ASDAS). O sangue será coletado dos pacientes antes do início do tratamento com glicocorticóides e medicamentos anti-reumáticos modificadores da doença (DMARDs: metotrexato, sulfasalazina e leflunomida) e 3 meses após atingir uma dose estável desses medicamentos. Para aqueles que iniciaram os bloqueadores de TNF, amostras de sangue serão coletadas após 6 meses do início da terapia. Como se espera que apenas uma minoria dessa coorte inicial precise ser tratada com antagonistas do TNF, um segundo grupo de 25 pacientes com AR e 25 com EA, selecionados para iniciar os antagonistas do TNF, será avaliado antes de iniciar a droga e 6 meses depois.

O consentimento informado por escrito será obtido de todos os pacientes antes de qualquer procedimento específico do protocolo e este estudo será conduzido de acordo com os regulamentos que regem os ensaios clínicos, como a Declaração de Helsinque, conforme alterada em Tóquio (2004). Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do HSM.

Todos os procedimentos nas tarefas a seguir serão realizados em pacientes com AR e EA (soro e sangue) e doadores saudáveis ​​(soro), salvo indicação em contrário.

Tarefa 2 - Estudo dos estímulos inflamatórios e marcadores de remodelação óssea Subpopulações de células do sistema imunológico (neutrófilos, subpopulações de células B e T, incluindo células Th17) serão analisadas quanto à expressão de RANKL de superfície por citometria de fluxo.

Citocinas pró-inflamatórias como IL-1β, IL-6, IL-17A, IL-20, IL-23, TNF e proteínas moduladoras ósseas (OPG, sRANKL, esclerostina e dikkopf-1) serão quantificadas por ELISA. Enzimas de degradação óssea como a fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP)5b e marcadores de remodelação óssea como telopeptídeo reticulado carboxiterminal de colágeno tipo I (ICTP) e pró-peptídeo aminoterminal de procolágeno tipo 1 (P1NP) também serão estudados.

Os dados obtidos dos experimentos de citometria de fluxo e quantificação de proteínas serão comparados entre doenças antes e após o tratamento e com doadores saudáveis. Isso nos permitirá entender as diferenças específicas da doença no ambiente inflamatório sistêmico e local em pacientes não tratados e o efeito das diferentes terapias sobre esse mesmo ambiente.

Tarefa 3 - Análise de precursores de osteoclastos e sua diferenciação em osteoclastos funcionais As células CD14+ circulantes serão caracterizadas pela análise de marcadores como HLA-DR, agrupamento de diferenciação (CD)16, CD86, CD11b e CD62L, bem como proteínas associadas à diferenciação de osteoclastos, como a integrina de superfície CD51/CD61 (integrina αVβ3), RANK (receptor ativador de nf-kappa beta) e o receptor de calcitonina por citometria de fluxo.

A fim de caracterizar completamente os precursores dos osteoclastos, a expressão de genes relacionados a osteoclastos como DC-STAMP, MITF (fator de transcrição associado à microftalmia), CTSK (catepsina K), TRACP e ATP6v0d2 em células CD14+ será avaliada por polimerase quantitativa em tempo real reação em cadeia (RT-qPCR). Os resultados obtidos serão normalizados com os genes housekeeping beta glucuronidase (GUSB) e fosfomanomutase-1 (PMM1).

Dados obtidos por citometria de fluxo e experimentos de expressão gênica serão comparados entre pacientes tratados e não tratados e com doadores saudáveis. Esta tarefa nos fornecerá informações quantitativas sobre as alterações específicas da doença da subpopulação de monócitos CD14+ e nos permitirá entender o efeito da terapia nas células precursoras circulantes.

Tarefa 4 - Função e dinâmica celular dos osteoclastos diferenciados Os monócitos CD14+ isolados serão cultivados por 21 dias na presença de M-CSF (fator estimulante de colônia de macrófagos) e hrRANKL (ativador do receptor recombinante humano do ligante nf-kappa beta) a 37º , 5% de CO2 em placas de cultura multipoços.

Os osteoclastos serão analisados ​​nos dias 7, 14 e 21 de cultivo para avaliação da dinâmica celular. A expressão de genes específicos de osteoclastos será analisada nesses pontos de tempo por RT-qPCR (ver Tarefa 3). A análise por citometria de fluxo será realizada para avaliar a expressão de superfície de CD51/CD61 e RANK. Os dados obtidos durante os pontos de tempo (dias 7, 14 e 21) de pacientes e controles saudáveis ​​serão comparados com os mesmos dados obtidos das células precursoras.

No 21º dia de cultivo as células serão utilizadas em dois ensaios funcionais: coloração TRAP e ensaio de reabsorção. No ensaio de coloração TRAP avaliaremos o número de osteoclastos formados em cultura por meio da contagem de células multinucleadas TRAP-positivas com mais de 3 núcleos (osteoclastos). A comparação desse valor com a contagem de núcleos em monócitos CD14+ em placas de cultura permitirá determinar o índice de fusão desses precursores. O ensaio de reabsorção é realizado através da cultura de monócitos sobre fatias ósseas e nos permite medir a atividade de reabsorção de osteoclastos funcionais. Isso será medido por análise de imagem das fatias ósseas coradas com azul de toluidina, onde a área reabsorvida adquire uma cor azul a roxa. A análise da taxa de fusão dos precursores e da área reabsorvida dos osteoclastos permitirá identificar diferenças na função dos osteoclastos entre pacientes com AR e EA e doadores saudáveis.

Tanto os monócitos quanto os osteoclastos serão estudados quanto às vias de sinalização RANK/RANKL e integrina αVβ3 e c-fms que levam ao recrutamento e ativação de TRAF6, tirosina quinase Src e quinase regulada por sinal extracelular (ERK)1/2 ativando NF- kB e outros fatores de transcrição. Estas vias de sinalização serão estudadas utilizando a plataforma Luminex xMAP com EpiQuant Cell Signaling Assays (Millipore). A comparação dos resultados de pacientes não tratados e controles nos permitirá entender se há prejuízo nas vias clássicas de diferenciação/ativação de osteoclastos na EA em relação à AR.

Os resultados obtidos em pacientes tratados e não tratados fornecerão informações sobre a ação das terapias na diferenciação e função dos osteoclastos. A comparação dos resultados gerais de pacientes não tratados e doadores saudáveis ​​nos permitirá entender as principais diferenças entre a diferenciação e a ativação dos osteoclastos nessas patologias.

Tarefa 5 - Função e dinâmica celular dos osteoblastos Num subgrupo de doentes com AR e EA submetidos a artroplastia da anca ou cirurgia cervical será estudada a diferenciação osteoblástica. Imediatamente após a cirurgia, um pequeno pedaço de osso trabecular (1cm3) será extraído da amostra para isolar os osteoblastos. Após o isolamento, os osteoblastos serão cultivados em meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM) suplementado com vitamina D3 (10-8M) e as células serão estudadas a 80% de confluência. A função dos osteoblastos será estudada in vitro pelo ensaio de metiltiazol tetrazólio (MTT) (proliferação celular), coloração com fosfatase alcalina e formação de nódulos de mineralização. As células também serão utilizadas para extração de RNA e análise de expressão gênica Genes específicos que codificam proteínas como osteopontina, colágeno tipo I, osteocalcina, fosfatase alcalina, RANKL, osteoprotegerina, runx2 e osterix serão analisados ​​para caracterizar as células isoladas. Esses resultados nos permitirão entender as diferenças na diferenciação e atividade osteoblástica entre as doenças.

Tarefa 6 - Ensaios de expressão gênica óssea Em um subgrupo de pacientes com AR e EA submetidos a artroplastia de quadril ou cirurgia cervical, congelaremos amostras ósseas a -80ºC. Com o osso ainda congelado, uma pequena amostra de osso trabecular será reduzida a pó fino em moinho criogênico e a extração de RNA será realizada com o reagente TRIzol. O RNA resultante será avaliado quanto à sua integridade e quantificado em um Bioanalyser. Portanto, o RNA extraído será o total de RNA presente no osso, proveniente do sangue, osteoblastos, osteoclastos, osteócitos, adipócitos e células da medula óssea.

A expressão gênica tanto no microambiente ósseo quanto nas células oriundas dos estudos in vitro será avaliada por RT-PCR. Genes específicos que codificam proteínas de osteoblastos e osteoclastos, como osteopontina, colágeno tipo I, osteocalcina, fosfatase alcalina, RANKL, osteoprotegerina, runx2, osterix, catepsina K, subunidade beta3 integrina, receptor de calcitonina, subunidade ATPase d2, TRAF6, RANK, TRAP , serão estudados os co-receptores OSCAR e TREM-2, entre outros. A atividade dos osteócitos também será avaliada pela expressão de genes específicos, SOST, Dkk1, DMP-1, Phex, antígeno E11, MEPE e CD44. Também serão estudados os genes que codificam as citocinas inflamatórias IL-1, IL-6, IL-17 e TNF.

Para avaliar a eficiência da PCR, curvas padrão serão construídas a partir de RNA extraído de amostras ósseas congeladas de indivíduos com densidade mineral óssea normal e sem nenhuma outra doença que possa influenciar no metabolismo ósseo. Os genes dos osteoclastos, osteoblastos e osteócitos de interesse serão quantificados pelo método da curva padrão.

O estudo da expressão do ARN nas amostras ósseas permitirá compreender a atividade celular local e caracterizar as células ósseas e a sua função num contexto de doença.