耐力运动期间补充支链氨基酸的代谢组学影响

研究设计 本研究采用随机、安慰剂对照、双盲交叉设计，比较在 60 分钟最大有氧能力的 65% 跑步前和跑步中途补充 BCAA 与安慰剂饮料。 为了分离 BCAA 对运动过程中血清素和新陈代谢的影响，在运动前后立即采集血样。 为 BCAA 设计了靶向代谢组学分析，以验证补充剂诱导的血清浓度增加，并为血清素设计以评估 BCAA 的影响。 进行了非靶向代谢组学分析，以确定补充 BCAA 对耐力运动期间代谢的整体代谢影响。

最大有氧能力 使用电动跑步机，使用分级运动测试来测量最大耗氧量 (VO2max)。 每个参与者都配备了一个电子心率 (HR) 监视器、一个喉舌和一个双向非重复呼吸管和一个鼻夹，所有这些都连接到标准实验室代谢推车（TrueOne 2400，ParvoMedics，Sandy，Utah ). 参与者自行选择 5 到 7.5 英里/小时之间的速度，并开始以 0% 的坡度跑步。 每分钟，跑步机倾斜度增加 1.5%，而速度保持不变，直到参与者因疲惫而自愿终止测试。 每个参与者的 VO2max 被定义为测试期间收集的最高 30 秒平均值。 然后确定 VO2max 的 65% 时的心率并将其用于实验性试验。

实验程序要求参与者在完成 VO2max 测试后不早于 72 小时返回实验室，以完成实验程序中两个试验中的第一个。 在每次试验前的 48 小时内，参与者被要求记录他们吃什么、喝什么以及是否服用任何药物。 要求所有参与者在试验前 48 小时内避免饮酒。 除了实验饮料外，这两个试验中的每一个在程序上都是相同的，并且间隔至少 72 小时。 每个参与者在一天中的同一时间进行测试，所有测试在下午 4:00 到 8:00 之间完成。

向参与者提供随机分配的饮料，其中含有 BCAA 或安慰剂溶液。 参与者在跑步试验前五分钟饮用实验饮料。 然后每个参与者都配备了心率监测器，并在摄入后三分钟抽血。 抽血后立即在跑步机上以自选速度进行两到五分钟的热身。 然后，每位参与者以 0% 坡度、最大摄氧量的 65% 开始他们的 60 分钟跑步试验。 在 60 分钟的试验进行到一半时，每个参与者都摄入了另一份指定的安慰剂或 BCAA 饮料。 在 60 分钟的试验中，每 10 分钟收集一次心率和自觉运动率 (RPE)。 在 60 分钟结束时，参与者在离开跑步机并完成运动后抽血之前冷静两分钟。 让血样凝结 15 分钟，然后在 4°C 下以 1200 RPM 离心 15 分钟。 然后将血清上清液收集在干净的小瓶中，并立即储存在-80°C，直到进行液相色谱质谱（LCMS）分析。 记录第一次试验期间的跑步机速度，并在第二次试验期间复制。

实验饮料 在双盲、随机交叉设计中，每位参与者都获得了 BCAA 补充剂溶液或安慰剂溶液。 BCAA 溶液是 8 盎司水与大约 8 克粉末形式的标准 BCAA 补充剂混合而成。 每 8 克剂量含有 2.5 克亮氨酸、1.25 克异亮氨酸和 1.25 克缬氨酸。 BCAA 的存在由 LCMS 确认。 安慰剂溶液是 8 盎司水与大约 2.0 mL 三氯蔗糖混合饮料的混合物。 BCAA 溶液和安慰剂溶液在颜色和味道上都相似。 如果需要，参与者可以在 60 分钟的跑步试验中额外饮用白开水。

代谢物提取 将血清样品解冻，取出 20μL 血清并放入干净的小瓶中。 加入 80μL 冷丙酮，然后在涡旋机上搅拌并在 -80°C 冰箱中搅拌两小时，完成蛋白质沉淀。 然后将血清在 -4°C 下以 20,000g 离心 10 分钟。 收集富含代谢物的上清液并使用负压浓缩至干燥（ConcentratorPlus，Eppendorf，Hamburg，Germany）。 然后将样品在 -80°C 下储存不超过 24 小时，直到准备好进行 LCMS 分析。 就在 LCMS 分析之前，将代谢物样品用 40μL 的甲醇：水 (50:50) 复溶并置于干净的质谱分析瓶中。

LCMS 条件 LCMS 分析在 Agilent 6538 Q-TOF MS（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）与 Agilent 1290 UHPLC（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）联用时使用 1.8μm、2.1mm X 150mm Waters HSST- 3 UPLC 色谱柱（沃特世公司，马萨诸塞州米尔福德）。 电喷雾电离处于正模式。 LC 流动相是水 (A) 和乙腈 (B)，均含有 0.1% 的甲酸。 流量保持恒定在每分钟 300µL。 流动相梯度从 95% A 开始，7 分钟后以 5% A 结束，然后在 8 分钟时返回到 95%，并持续到 10 分钟运行时间结束。 柱室温度保持恒定在 30°C。 MSMS 分析是在相同的条件下使用合并的提取血清样品完成的。

数据分析 5-羟色胺标准品（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州）在所述 LCMS 条件下进行分析，并确定保留时间和 m/z 值。 分析了 0.001µM、0.01µM、0.05µM、0.1µM、0.5µM、1µM 和 5µM 的浓度，以创建标准浓度曲线并确定检测限。 然后对来自参与者血清样本的血清素峰进行积分，并使用 MassHunter（安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州）根据标准曲线计算浓度。 对于非目标数据分析，原始数据文件被转换为 .mzML 和 .mgf 使用 MSConvert 提取文件，然后使用 mzMine 进行挖掘。 还使用不含血清的相同代谢物程序创建空白样品，并同时在相同的 LCMS 条件下进行分析。 生成的样品空白数据也与样品数据一起转换和挖掘，并用于去除机器背景和流动相对数据的贡献。 然后分别使用 MetaboAnalyst 和 Sirius 软件对清理后的数据集和 MSMS 数据进行统计分析。 还使用 LCMS 检查了 BCAA 补充剂，并对结果进行了分析，以确认是否存在 BCAA 和添加剂，包括调味剂和甜味剂。

统计分析 血清素浓度使用 caret R 包进行标准化和中心缩放。 归一化后，完成嵌套方差分析，血清素浓度作为因变量，治疗和时间作为自变量。 嵌套方差分析的结果导致了对组的进一步探索，并且在治疗组和时间组之间进行了 t 检验。