Metabolomiska effekter av grenad aminosyratillskott under uthållighetsträning

Forskningsdesign Denna studie använde en randomiserad, placebokontrollerad, dubbelblind crossover-design som jämförde tillskott av BCAA med placebodrycker som konsumerades omedelbart före och halvvägs genom en 60-minuterskörning med 65 % av maximal aerob kapacitet. För att isolera effekten av BCAA på serotonin och ämnesomsättning under träning, togs blodprover omedelbart före och efter träning. En målinriktad metabolomisk analys utformades för BCAA för att verifiera tillskottsinducerade ökningar av serumkoncentrationen, såväl som för serotonin för att bedöma effekterna av BCAA. Oriktad metabolomisk analys utfördes för att identifiera globala metaboliska effekter av BCAA-tillskott på ämnesomsättningen under uthållighetsträning.

Maximal aerobic kapacitet Ett graderat träningstest användes för att mäta maximal syreförbrukning (VO2max) med ett motoriserat löpband. Varje deltagare försågs med en elektronisk pulsmätare (HR), ett munstycke och ett tvåvägsrör utan återandning och en näsklämma, som alla var anslutna till en standardlaboratoriemetabolisk vagn (TrueOne 2400, ParvoMedics, Sandy, Utah ). Deltagarna valde själv en hastighet mellan 5 och 7,5 mph och började springa i 0 % lutning. Varje minut ökades löpbandets lutning med 1,5 % medan hastigheten förblev konstant tills deltagaren frivilligt avbröt testet på grund av utmattning. Varje deltagares VO2max definierades som det högsta 30 sekunders medelvärde som samlades in under testet. Hjärtfrekvens vid 65 % av VO2max bestämdes sedan och användes för de experimentella försöken.

Experimentell procedur Deltagarna ombads att återvända till labbet tidigast 72 timmar efter slutförandet av VO2max-testet för att slutföra den första av två försök i den experimentella proceduren. Under de 48 timmarna före varje försök ombads deltagarna att registrera vad de åt, drack och om de tog några mediciner. Alla deltagare ombads att avstå från att konsumera alkohol inom 48 timmar före försöken. Med undantag för den experimentella drycken, var var och en av de två försöken identisk i tillvägagångssätt och separerades med minst 72 timmar. Testning utfördes vid samma tid på dagen för varje deltagare och alla tester genomfördes mellan 16:00 och 20:00.

Deltagarna fick en slumpmässigt tilldelad dryck innehållande antingen BCAA eller en placebolösning. Deltagarna konsumerade den experimentella drycken fem minuter före deras löpande prov. Varje deltagare försågs sedan med en HR-monitor och blod togs tre minuter efter intag. Blodtagningen följdes omedelbart av en uppvärmning på löpbandet med en självvald hastighet under två till fem minuter. Varje deltagare började sedan sitt 60-minuters löpprov med 0 % lutning vid 65 % av sitt fastställda VO2max. Halvvägs in i 60-minutersstudien intog varje deltagare ytterligare en portion av den tilldelade placebo- eller BCAA-drycken. Hjärtfrekvens och frekvensen av upplevd ansträngning (RPE) samlades var 10:e minut under 60-minutersförsöket. Vid slutet av de 60 minuterna svalnade deltagarna i två minuter innan de lämnade löpbandet och slutförde blodprovet efter träningen. Blodprover fick koagulera under 15 minuter följt av centrifugering vid 1200 rpm under 15 minuter vid 4°C. Serumsupernatanten uppsamlades sedan i rena flaskor och förvarades omedelbart vid -80°C tills vätskekromatografimasspektrometri (LCMS) analys. Löpbandshastigheten under det första försöket registrerades och replikerades under det andra försöket.

Experimentella drycker Varje deltagare fick en BCAA-tillskottslösning eller en placebolösning i en dubbelblind, randomiserad crossover-design. BCAA-lösningen var 8 oz vatten blandat med cirka 8 gram av ett standard BCAA-tillskott i pulverform. Varje 8 grams dos innehöll 2,5 gram leucin, 1,25 gram isoleucin och 1,25 gram valin. Närvaron av BCAA bekräftades av LCMS. Placebolösningen var 8 oz vatten blandat med cirka 2,0 ml av en sukralosbaserad dryckesblandning. Både BCAA-lösningen och placebolösningen var lika i färg och smak. Deltagarna fick dricka ytterligare vanligt vatten under det 60 minuter långa löpprovet om så önskades.

Metabolitextraktion Serumprover tinades och 20 μL serum avlägsnades och placerades i en ren flaska. Proteinfällning fullbordades med tillsats av 80 μL kall aceton följt av omrörning på en vortexmaskin och två timmar i en -80°C frys. Serum centrifugerades sedan vid 20 000 g under 10 minuter vid -4°C. Den metabolitrika supernatanten uppsamlades och koncentrerades med användning av undertryck till torrhet (ConcentratorPlus, Eppendorf, Hamburg, Tyskland). Prover förvarades sedan vid -80°C i högst 24 timmar tills de var klara för LCMS-analys. Direkt före LCMS-analys rekonstituerades metabolitprover med 40 μL metanol:vatten (50:50) och placerades i en ren masspektrometriflaska.

LCMS-förhållanden LCMS-analys utfördes på en Agilent 6538 Q-TOF MS (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) kopplad till en Agilent 1290 UHPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) med användning av en 1,8 μm, 2,1 mm X 150 mm Waters HSST 3 UPLC-kolonn (Waters Corp., Milford, MA). Elektrosprayjonisering var i positivt läge. LC mobila faser var vatten (A) och acetonitril (B), båda med 0,1% myrsyra. Flödet hölls konstant vid 300 ul per minut. Den mobila fasgradienten började med 95 % A och slutade med 5 % A efter sju minuter innan den återgick till 95 % vid åtta minuter och fortsatte till slutet av den tio minuter långa körtiden. Kolonnavdelningens temperatur hölls konstant vid 30°C. MSMS-analys avslutades med identiska förhållanden med poolade extraherade serumprover.

Dataanalys Serotoninstandarder (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) analyserades under de beskrivna LCMS-förhållandena och retentionstiden och m/z-värdet bestämdes. Koncentrationer av 0,001 µM, 0,01 µM, 0,05 µM, 0,1 µM, 0,5 µM, 1 µM och 5 µM analyserades vilket möjliggjorde skapandet av en standardkoncentrationskurva och bestämning av detektionsgränsen. Toppar för serotonin från deltagande serumprover integrerades sedan och koncentrationen beräknades från standardkurvan med användning av MassHunter (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). För den oriktade dataanalysen konverterades rådatafilerna till .mzML och .mgf filer med MSConvert och bryts sedan med mzMine. Tomprover skapades också med samma metabolitprocedur utan serum och analyserades under identiska LCMS-förhållanden samtidigt. De resulterande blankprovsdata konverterades också och minerades med provdata och användes för att ta bort maskinbakgrunds- och mobilfasbidrag till data. Rensade datauppsättningar och MSMS-data analyserades sedan statistiskt med hjälp av MetaboAnalyst respektive Sirius programvara. BCAA-tillskottet undersöktes också med LCMS och resultaten analyserades för att bekräfta närvaron av BCAA och tillsatser inklusive smak- och sötningsmedel.

Statistisk analys Serotoninkoncentrationer normaliserades och centrerades med användning av caret R-paketet. Efter normalisering fullbordades en kapslad ANOVA med serotoninkoncentration som beroende variabel och behandling och tid som oberoende variabler. Resultaten av den kapslade ANOVA-analysen ledde till ytterligare utforskning av grupperna och t-tester utfördes mellan behandlings- och tidsgrupperingar.