Impactos metabolómicos de la suplementación con aminoácidos de cadena ramificada durante el ejercicio de resistencia

Diseño de la investigación Este estudio utilizó un diseño cruzado aleatorizado, controlado con placebo y doble ciego que comparó la suplementación de BCAA con las bebidas de placebo consumidas inmediatamente antes y en la mitad de una carrera de 60 minutos al 65 % de la capacidad aeróbica máxima. Para aislar el impacto de los BCAA en la serotonina y el metabolismo durante el ejercicio, se recolectaron muestras de sangre inmediatamente antes y después del ejercicio. Se diseñó un análisis metabolómico dirigido para BCAA para verificar los aumentos inducidos por la suplementación en la concentración sérica, así como para la serotonina para evaluar los impactos de los BCAA. Se realizó un análisis metabolómico no dirigido para identificar los impactos metabólicos globales de la suplementación con BCAA en el metabolismo durante el ejercicio de resistencia.

Capacidad aeróbica máxima Se utilizó una prueba de ejercicio graduada para medir el consumo máximo de oxígeno (VO2max) utilizando una cinta rodante motorizada. A cada participante se le colocó un monitor electrónico de frecuencia cardíaca (FC), una boquilla y un tubo de no reinhalación de dos vías y una pinza nasal, todos los cuales estaban conectados a un carro metabólico de laboratorio estándar (TrueOne 2400, ParvoMedics, Sandy, Utah ). Los participantes seleccionaron una velocidad entre 5 y 7.5 mph y comenzaron a correr con una inclinación del 0 %. Cada minuto, la inclinación de la cinta rodante aumentaba un 1,5 %, mientras que la velocidad permanecía constante hasta que el participante finalizaba voluntariamente la prueba debido al agotamiento. El VO2max de cada participante se definió como el valor promedio más alto de 30 segundos recopilado durante la prueba. Luego se determinó la frecuencia cardíaca al 65% del VO2max y se usó para las pruebas experimentales.

Procedimiento experimental Se pidió a los participantes que regresaran al laboratorio no antes de las 72 horas posteriores a la finalización de la prueba de VO2max para completar la primera de las dos pruebas del procedimiento experimental. En las 48 horas previas a cada prueba, se pidió a los participantes que registraran lo que comían, bebían y si tomaban algún medicamento. Se pidió a todos los participantes que se abstuvieran de consumir alcohol dentro de las 48 horas previas a las pruebas. Con la excepción de la bebida experimental, cada uno de los dos ensayos tuvo un procedimiento idéntico y estuvieron separados por al menos 72 horas. Las pruebas se realizaron a la misma hora del día para cada participante y todas las pruebas se completaron entre las 4:00 p. m. y las 8:00 p. m.

A los participantes se les proporcionó una bebida asignada al azar que contenía BCAA o una solución de placebo. Los participantes consumieron la bebida experimental cinco minutos antes de su prueba de carrera. Luego, a cada participante se le colocó un monitor de frecuencia cardíaca y se extrajo sangre tres minutos después de la ingestión. La extracción de sangre fue seguida inmediatamente por un calentamiento en la cinta rodante a una velocidad seleccionada por ellos mismos durante dos a cinco minutos. Luego, cada participante comenzó su prueba de carrera de 60 minutos con una inclinación del 0% al 65% de su VO2max establecido. A la mitad de la prueba de 60 minutos, cada participante ingirió otra porción del placebo asignado o la bebida BCAA. La frecuencia cardíaca y la tasa de esfuerzo percibido (RPE) se recogieron cada 10 minutos durante la prueba de 60 minutos. Al final de los 60 minutos, los participantes se enfriaron durante dos minutos antes de salir de la caminadora y completar la extracción de sangre posterior al ejercicio. Las muestras de sangre se dejaron coagular durante 15 minutos seguido de centrifugación a 1200 RPM durante 15 minutos a 4°C. A continuación, el sobrenadante de suero se recogió en viales limpios y se almacenó inmediatamente a -80 °C hasta el análisis de espectrometría de masas por cromatografía líquida (LCMS). La velocidad de la cinta rodante durante la primera prueba se registró y repitió durante la segunda prueba.

Bebidas experimentales Cada participante recibió una solución de suplemento de BCAA o una solución de placebo en un diseño cruzado aleatorio doble ciego. La solución de BCAA era 8 oz de agua mezclada con aproximadamente 8 gramos de un suplemento de BCAA estándar en forma de polvo. Cada dosis de 8 gramos contenía 2,5 gramos de leucina, 1,25 gramos de isoleucina y 1,25 gramos de valina. La presencia de BCAA fue confirmada por LCMS. La solución de placebo consistía en 8 onzas de agua mezclada con aproximadamente 2,0 ml de una mezcla para bebidas a base de sucralosa. Tanto la solución de BCAA como la solución de placebo eran similares en color y sabor. A los participantes se les permitió beber agua corriente adicional durante la prueba de carrera de 60 minutos si así lo deseaban.

Extracción de metabolitos Las muestras de suero se descongelaron y se extrajeron 20 μl de suero y se colocaron en un vial limpio. La precipitación de proteínas se completó con la adición de 80 μL de acetona fría seguido de agitación en una máquina de vórtice y dos horas en un congelador a -80 °C. A continuación, el suero se centrifugó a 20.000 g durante 10 minutos a -4 °C. El sobrenadante rico en metabolitos se recogió y se concentró utilizando presión negativa hasta sequedad (ConcentratorPlus, Eppendorf, Hamburgo, Alemania). A continuación, las muestras se almacenaron a -80 °C durante no más de 24 horas hasta que estuvieran listas para el análisis LCMS. Directamente antes del análisis LCMS, las muestras de metabolitos se reconstituyeron con 40 μL de metanol:agua (50:50) y se colocaron en un vial de espectrometría de masas limpio.

Condiciones de LCMS El análisis de LCMS se realizó en un MS Agilent 6538 Q-TOF (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) acoplado a un Agilent 1290 UHPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) utilizando un HSST Waters de 1,8 μm, 2,1 mm X 150 mm. 3 Columna UPLC (Waters Corp., Milford, MA). La ionización por electropulverización estaba en modo positivo. Las fases móviles de CL fueron agua (A) y acetonitrilo (B), ambas con ácido fórmico al 0,1 %. El flujo se mantuvo constante a 300 µl por minuto. El gradiente de fase móvil comenzó con 95 % de A y terminó con 5 % de A después de siete minutos antes de volver a 95 % a los ocho minutos y continuar hasta el final del tiempo de ejecución de diez minutos. La temperatura del compartimento de la columna se mantuvo constante a 30°C. El análisis de MSMS se completó utilizando condiciones idénticas con muestras de suero extraídas agrupadas.

Análisis de datos Se analizaron patrones de serotonina (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) en las condiciones de LCMS descritas y se determinaron el tiempo de retención y el valor m/z. Se analizaron concentraciones de 0,001 µM, 0,01 µM, 0,05 µM, 0,1 µM, 0,5 µM, 1 µM y 5 µM, lo que permitió la creación de una curva de concentración estándar y la determinación del límite de detección. Luego se integraron los picos de serotonina de las muestras de suero de los participantes y se calculó la concentración a partir de la curva estándar usando MassHunter (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Para el análisis de datos no dirigido, los archivos de datos sin procesar se convirtieron a .mzML y .mgf archivos usando MSConvert y luego extraídos usando mzMine. También se crearon muestras en blanco utilizando el mismo procedimiento de metabolitos sin suero y se analizaron en condiciones idénticas de LCMS al mismo tiempo. Los datos en blanco de muestra resultantes también se convirtieron y extrajeron con los datos de muestra y se usaron para eliminar las contribuciones de la fase móvil y el fondo de la máquina a los datos. Los conjuntos de datos limpios y los datos de MSMS luego se analizaron estadísticamente utilizando el software MetaboAnalyst y Sirius, respectivamente. El suplemento de BCAA también se examinó mediante LCMS y los resultados se analizaron para confirmar la presencia de BCAA y aditivos, incluidos los agentes saborizantes y edulcorantes.

Análisis estadístico Las concentraciones de serotonina se normalizaron y escalaron al centro usando el paquete caret R. Después de la normalización, se completó un ANOVA anidado con la concentración de serotonina como variable dependiente y el tratamiento y el tiempo como variables independientes. Los resultados del análisis ANOVA anidado condujeron a una mayor exploración de los grupos y se realizaron pruebas t entre el tratamiento y las agrupaciones temporales.