Impatti metabolomici dell'integrazione di aminoacidi a catena ramificata durante l'esercizio di resistenza

Disegno della ricerca Questo studio ha utilizzato un disegno crossover randomizzato, controllato con placebo, in doppio cieco, confrontando l'integrazione di BCAA rispetto alle bevande placebo consumate immediatamente prima ea metà di una corsa di 60 minuti al 65% della capacità aerobica massima. Per isolare l'impatto dei BCAA sulla serotonina e sul metabolismo durante l'esercizio, sono stati raccolti campioni di sangue immediatamente prima e dopo l'esercizio. È stata progettata un'analisi metabolomica mirata per i BCAA per verificare gli aumenti della concentrazione sierica indotti dall'integrazione, nonché per la serotonina per valutare gli impatti dei BCAA. È stata eseguita un'analisi metabolomica non mirata per identificare gli impatti metabolici globali dell'integrazione di BCAA sul metabolismo durante l'esercizio di resistenza.

Capacità aerobica massima È stato utilizzato un test di esercizio graduato per misurare il consumo massimo di ossigeno (VO2max) utilizzando un tapis roulant motorizzato. Ogni partecipante è stato dotato di un cardiofrequenzimetro elettronico (HR), un boccaglio e un tubo a due vie non rebreathing e una clip per il naso, tutti collegati a un carrello metabolico standard da laboratorio (TrueOne 2400, ParvoMedics, Sandy, Utah ). I partecipanti hanno selezionato autonomamente una velocità compresa tra 5 e 7,5 mph e hanno iniziato a correre con un'inclinazione dello 0%. Ogni minuto, l'inclinazione del tapis roulant è stata aumentata dell'1,5% mentre la velocità è rimasta costante fino a quando il partecipante ha interrotto volontariamente il test a causa dell'esaurimento. Il VO2max di ciascun partecipante è stato definito come il valore medio più alto di 30 secondi raccolto durante il test. La frequenza cardiaca al 65% del VO2max è stata quindi determinata e utilizzata per le prove sperimentali.

Procedura sperimentale Ai partecipanti è stato chiesto di tornare in laboratorio non prima di 72 ore dopo il completamento del test VO2max per completare la prima delle due prove della procedura sperimentale. Nelle 48 ore precedenti ogni prova, ai partecipanti è stato chiesto di registrare cosa stavano mangiando, bevendo e se assumevano farmaci. A tutti i partecipanti è stato chiesto di astenersi dal consumare alcol nelle 48 ore precedenti le prove. Con l'eccezione della bevanda sperimentale, ciascuna delle due prove era identica nella procedura ed era separata da almeno 72 ore. I test sono stati eseguiti alla stessa ora del giorno per ciascun partecipante e tutti i test sono stati completati tra le 16:00 e le 20:00.

Ai partecipanti è stata fornita una bevanda assegnata in modo casuale contenente BCAA o una soluzione placebo. I partecipanti hanno consumato la bevanda sperimentale cinque minuti prima della prova di corsa. Ogni partecipante è stato quindi dotato di un cardiofrequenzimetro e il sangue è stato prelevato tre minuti dopo l'ingestione. Il prelievo di sangue è stato immediatamente seguito da un riscaldamento sul tapis roulant a una velocità autoselezionata per 2-5 minuti. Ogni partecipante ha quindi iniziato la prova di corsa di 60 minuti con una pendenza dello 0% al 65% del VO2max stabilito. A metà della prova di 60 minuti, ogni partecipante ha ingerito un'altra porzione del placebo assegnato o della bevanda BCAA. La frequenza cardiaca e il tasso di sforzo percepito (RPE) sono stati raccolti ogni 10 minuti durante la prova di 60 minuti. Al termine dei 60 minuti, i partecipanti si sono raffreddati per due minuti prima di uscire dal tapis roulant e completare il prelievo di sangue post-esercizio. I campioni di sangue sono stati lasciati coagulare per 15 minuti seguiti da centrifugazione a 1200 RPM per 15 minuti a 4°C. Il surnatante di siero è stato quindi raccolto in fiale pulite e immediatamente conservato a -80°C fino all'analisi di spettrometria di massa con cromatografia liquida (LCMS). La velocità del tapis roulant durante la prima prova è stata registrata e replicata durante la seconda prova.

Bevande sperimentali Ad ogni partecipante è stata fornita una soluzione di supplemento di BCAA o una soluzione di placebo in un design incrociato randomizzato in doppio cieco. La soluzione BCAA era composta da 8 once di acqua mescolata con circa 8 grammi di un integratore BCAA standard in polvere. Ogni dose da 8 grammi conteneva 2,5 grammi di leucina, 1,25 grammi di isoleucina e 1,25 grammi di valina. La presenza di BCAA è stata confermata da LCMS. La soluzione placebo era composta da 8 once di acqua mescolata con circa 2,0 ml di una bevanda a base di sucralosio. Sia la soluzione BCAA che la soluzione placebo erano simili nel colore e nel gusto. I partecipanti potevano bere altra acqua naturale durante la prova di corsa di 60 minuti, se lo desideravano.

Estrazione del metabolita I campioni di siero sono stati scongelati e 20 μL di siero sono stati rimossi e posti in una fiala pulita. La precipitazione delle proteine ​​è stata completata con l'aggiunta di 80μL di acetone freddo seguita da agitazione su una macchina vortex e due ore in un congelatore a -80°C. Il siero è stato quindi centrifugato a 20.000 g per 10 minuti a -4°C. Il surnatante ricco di metaboliti è stato raccolto e concentrato utilizzando una pressione negativa per la secchezza (ConcentratorPlus, Eppendorf, Amburgo, Germania). I campioni sono stati quindi conservati a -80°C per non più di 24 ore fino al momento dell'analisi LCMS. Direttamente prima dell'analisi LCMS, i campioni di metaboliti sono stati ricostituiti con 40 μL di metanolo:acqua (50:50) e collocati in una fiala pulita per spettrometria di massa.

Condizioni LCMS L'analisi LCMS è stata eseguita su un Agilent 6538 Q-TOF MS (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) accoppiato a un Agilent 1290 UHPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) utilizzando un HSST Waters da 1,8 μm, 2,1 mm x 150 mm 3 Colonna UPLC (Waters Corp., Milford, MA). La ionizzazione elettrospray era in modalità positiva. Le fasi mobili LC erano acqua (A) e acetonitrile (B), entrambe con acido formico allo 0,1%. Il flusso è stato mantenuto costante a 300 µL al minuto. Il gradiente della fase mobile è iniziato con il 95% di A e si è concluso con il 5% di A dopo sette minuti prima di tornare al 95% dopo otto minuti e continuare fino alla fine del tempo di esecuzione di dieci minuti. La temperatura del compartimento colonna è stata mantenuta costante a 30°C. L'analisi MSMS è stata completata utilizzando condizioni identiche con campioni di siero estratti in pool.

Analisi dei dati Gli standard di serotonina (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) sono stati analizzati nelle condizioni LCMS descritte e sono stati determinati il ​​tempo di ritenzione e il valore m/z. Concentrazioni di 0,001 µM, 0,01 µM, 0,05 µM, 0,1 µM, 0,5 µM, 1 µM e 5 µM sono state analizzate consentendo la creazione di una curva di concentrazione standard e la determinazione del limite di rilevamento. I picchi per la serotonina dai campioni di siero dei partecipanti sono stati quindi integrati e la concentrazione è stata calcolata dalla curva standard utilizzando MassHunter (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Per l'analisi dei dati non mirati, i file di dati grezzi sono stati convertiti in .mzML e .mgf file utilizzando MSConvert e quindi estratti utilizzando mzMine. Anche i campioni bianchi sono stati creati utilizzando la stessa procedura del metabolita senza siero e sono stati analizzati contemporaneamente in condizioni LCMS identiche. Anche i dati del campione in bianco risultanti sono stati convertiti ed estratti con i dati del campione e sono stati utilizzati per rimuovere i contributi della fase mobile e dello sfondo della macchina ai dati. I set di dati puliti e i dati MSMS sono stati quindi analizzati statisticamente utilizzando rispettivamente il software MetaboAnalyst e Sirius. Anche il supplemento BCAA è stato esaminato utilizzando LCMS e i risultati sono stati analizzati per confermare la presenza di BCAA e additivi inclusi agenti aromatizzanti e dolcificanti.

Analisi statistica Le concentrazioni di serotonina sono state normalizzate e scalate al centro utilizzando il pacchetto R caret. Dopo la normalizzazione, è stata completata un'ANOVA nidificata con la concentrazione di serotonina come variabile dipendente e il trattamento e il tempo come variabili indipendenti. I risultati dell'analisi ANOVA nidificata hanno portato a un'ulteriore esplorazione dei gruppi e sono stati eseguiti test t tra il trattamento e i raggruppamenti temporali.