睡眠呼吸暂停和高血压对肠道微生物组的影响

1. 参与者 2017 年 7 月至 2017 年 11 月在北京大学第一医院睡眠实验室接受过夜多导睡眠监测（PSG）的参与者被纳入研究。 本研究经北京大学第一医院伦理委员会批准。 该研究遵守赫尔辛基宣言，并为患者保密。 所有参与者都签署了知情同意书。 纳入标准如下：（1）年龄18岁以上； (2) 因打鼾而接受 PSG 研究的门诊和住院患者； (3)自愿参加本研究并签署知情同意书者。 排除标准为：（1）入组前接受过OSA治疗（常规CPAP治疗、口腔矫治器、颌面手术等）的患者； (2)有明确原发病因的继发性HT患者； (3)有消化不良病史者(消化道手术史、消化性溃疡、炎症性肠病、慢性胰腺炎等)； (4) 器官功能不全者，正在接受免疫剂或葡萄糖； （5）最近2个月内接受过抗生素治疗或最近2个月内连续（每天）服用益生菌产品（酸奶、牛奶、奶酪等）者。 (6) 酒精或药物依赖。
2. 问卷调查采用统一设计的问卷，包括一般信息、既往HT史、冠心病、糖尿病、近期感染史、用药史、吸烟饮酒史、饮食习惯等问题。

3. 阻塞性睡眠呼吸暂停评估和 HBI 计算 患者接受定期夜间 PSG（Compumedics，E 系列）。 标准 PSG 是根据美国睡眠医学学会手册 (AASM)[11] 进行的；即六个脑电图 (EEG) 通道（C3-M2、C4-M1、F3-M2、F4-M1、O1-M2、O2-M1）、两个眼电图通道（E1-M2、E1-M2）、下巴肌电图（EMG1-EMG2、EMG1-EMG3）、心电图、呼吸（鼻压、气流）、SpO2、腹部和胸部运动以及腿部运动被记录下来。

   睡眠阶段分为三个非快速眼动（N1、N2、N3）、快速眼动 (R) 和清醒 (W) 阶段。 呼吸事件包括阻塞性呼吸暂停、中枢性呼吸暂停、混合性呼吸暂停和呼吸不足。 计算呼吸暂停和呼吸不足指数 (AHI)（每小时呼吸暂停和呼吸不足事件的次数之和）。 根据美国睡眠医学学会手册 2.3 对睡眠阶段、呼吸暂停和呼吸不足事件进行评分。

   HBI（缺氧负荷指数）计算为脱饱和曲线下的积分面积除以 TST。 通过计算氧饱和度降低到90%以下与相应时间的积分得到去饱和曲线下面积。 较高的 HBI 值与较高的缺氧负荷（持续时间和程度）相关。 使用适用于 Windows 的 MATLAB 2016（The Mathworks, Inc., Natick, USA）进行计算。 具体方法参考我们之前的报道。

4. 血压测量和标本采集 在入睡前和醒来后立即测量血压。 次日清晨采集患者粪便样本1-3g，研究者立即冷冻于-80℃冰箱中备用。

5. 信息收集、录入和参与者分组。 将问卷中所有参与者的入组人数、性别、年龄、身高、体重、Epworth 睡眠量表（ESS）、HT 和用药情况、其他主要病史和个人史，以及主要是 AHI 的 PSG 报告参数编制并录入电子表格。

   根据是否确诊原发性 HT 和 OSA（AHI ≥15 次/小时（国际睡眠障碍分类（第 3 版）），参与者被分为四组，如下。 没有 OSA 和 HT 的个体属于 OSA0HT0 组；同时患有 OSA 和 HT 的个体属于 OSA1HT1 组；没有 OSA 但有 HT 的个体属于 OSA0HT1 组；患有 OSA 但没有 HT 的个体属于 OSA1HT0 组。

6. 对所有粪便样本进行肠道微生物组 DNA 提取和 16S rRNA 编码基因测序的 16S rRNA 测序分析。 这部分实验和分析在诺禾致源生物信息技术有限公司（中国北京）进行。

7. 粪便分析 7.1。 基因组 DNA 的提取 根据制造商的说明，使用十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)/十二烷基磺酸钠 (SDS) 从人类粪便样本中提取总基因组 DNA。 在 1% 琼脂糖凝胶上监测 DNA 浓度和纯度。

   7.2. 扩增子生成不同区域的 16S rRNA/18S rRNA/ITS 基因（16S V4/16S V3/16S V3-V4/16S V4-V5、18S V4/18S V9、ITS1/ITS2 和 Arc V4）使用特异性引物进行扩增（例如16S V4：515F-806R，18S V4：528F-706R，18S V9：1380F-1510R等。 al) 带有条形码。 所有聚合酶链反应 (PCR) 均使用 Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix (New England, Biolabs) 进行。

   7.3. 聚合酶链反应产物混合纯化 将等体积的1X loading buffer（含SYB green）与PCR产物混合，2%琼脂糖凝胶电泳检测。 PCR 产物以等密度比混合。 然后，用 GeneJETTM 凝胶提取试剂盒 (Thermo Scientific) 纯化 PCR 产物的混合物。

   7.4. 文库制备和测序 测序文库是根据制造商的建议，使用 Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns (Thermo Scientific) 生成的。 在荧光计（Qubit 2.0；Thermo Scientific）上评估文库质量。 最后，在 Ion S5TM XL 平台上对文库进行测序，并生成 400 bp/600 bp 单端读取。

8. 生物信息学和统计分析 8.1． 8.1.1 单端读取组装和质量控制 数据拆分单端读取根据其独特的条形码分配给样本，并通过切断条形码和引物序列进行截断。

8.1.2 数据过滤 根据Cutadapt（V1.9.1）质量控制流程，在特定过滤条件下对raw reads进行质量过滤，以获得高质量的clean reads。

8.1.3 Chimera removal 将reads与参考数据库（Gold database）进行比较，使用UCHIME算法检测嵌合序列，然后将其移除。 然后终于得到了Effective Tags。

8.2. 操作分类单元聚类和物种注释 8.2.1 操作分类单元生产 序列分析由 Uparse 软件 (Uparse v7.0.1001) 执行。 相似性≥97% 的序列被分配到相同的操作分类单元 (OTU)。 筛选每个 OTU 的代表性序列以供进一步注释。

8.2.2 物种注释 对于每个代表序列，使用基于RDP 分类器（2.2 版）算法的Silva 数据库对分类信息进行注释。

8.2.3 系统发育关系构建 为了研究不同OTU之间的系统发育关系，以及不同样品（组）中优势种的差异，采用多序列比对对数期望（MUSCLE）软件进行多序列比对（版本 3.8.31）。

8.2.4 数据归一化 OTU 丰度信息使用与序列最少的样本对应的标准序列号进行归一化。 随后的 alpha 多样性和 beta 多样性分析都是基于这个输出的归一化数据进行的。 计算了 Chao1、Shannon 和 Simpson 指数来估计 alpha 多样性，并使用主坐标分析 (PCoA) 来表示 beta 多样性。

8.3. Alpha Diversity Alpha diversity 通过 observed species、Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Good-coverage 六个指标来分析样本中物种多样性的复杂性。 所有这些指标均使用 QIIME（Version1.7.0）计算并使用 R 软件（Version 2.15.3）显示。 选择 Chao1 和 ACE 来识别社区丰富度。 Shannon 和 Simpson 指数用于识别社区多样性。

8.4. Beta 多样性 Beta 多样性分析用于评估样本在物种复杂性方面的差异。 通过 QIIME 软件（版本 1.7.0）计算加权和未加权单分数的 Beta 多样性。 PCoA 用于表示 Beta 多样性。