Effekten av søvnapné og hypertensjon på tarmmikrobiom

1. Deltakere Deltakere som gjennomgikk overnight polysomnography (PSG) i søvnlaboratoriet ved Peking University First Hospital fra juli 2017 til november 2017 ble inkludert i studien. Denne studien ble godkjent av den etiske komiteen ved Peking University First Hospital. Studien fulgte Helsinki-erklæringen, og pasientens konfidensialitet ble opprettholdt. Alle deltakerne signerte skjemaet for informert samtykke. Inklusjonskriteriene var som følger: (1) alder 18 år eller eldre; (2) polikliniske og inneliggende pasienter som gjennomgikk en PSG-studie for snorking; (3) de som meldte seg frivillig til denne studien og signerte et informert samtykkeskjema. Eksklusjonskriterier var: (1) pasienter som ble behandlet for OSA (vanlig CPAP-terapi, orale apparater, maxillofacial kirurgi, etc.) før påmelding; (2) pasienter med sekundær HT med en klar primær årsak; (3) de med en historie med dyspeptisk sykdom (historie med gastrointestinal kirurgi, magesår, inflammatorisk tarmsykdom, kronisk pankreatitt, etc.); (4) de som hadde organinsuffisiens, mottok immunmidler eller glukose; (5) de som hadde fått antibiotikabehandling de siste 2 månedene eller hadde tatt probiotiske produkter (yoghurt, melk, ost osv.) kontinuerlig (daglig) de siste 2 månedene. (6) Alkohol- eller narkotikaavhengighet.
2. Spørreskjemaundersøkelse Et ensartet utformet spørreskjema inkludert spørsmål om generell informasjon, tidligere historie med HT, koronar hjertesykdom, diabetes mellitus, nyere historie med infeksjon, medisinering, røyke- og drikkehistorie og kostholdsvaner ble brukt.

3. Obstruktiv søvnapnévurdering og HBI-beregning Pasientene gjennomgikk vanlig PSG over natten (Compumedics, E-Series). Standard PSG ble utført i henhold til American Academy of Sleep Medicine manual (AASM)[11]; det vil si seks elektroencefalografi (EEG) kanaler (C3-M2, C4-M1, F3-M2, F4-M1, O1-M2, O2-M1), to elektrookulografikanaler (E1-M2, E1-M2), hakeelektromyografi (EMG1-EMG2, EMG1-EMG3), elektrokardiografi, respirasjon (nesetrykk, luftstrøm), SpO2, mage- og brystbevegelser og benbevegelser ble registrert.

   Søvnstadier ble delt inn i tre ikke-REM (N1, N2, N3), REM (R) og våken (W) stadier. Respiratoriske hendelser inkluderte obstruktiv apné, sentral apné, blandet apné og hypopné. Apné- og hypopnéindeksen (AHI) (summen av antall apné- og hypopnéhendelser per time) ble beregnet. Hendelser i søvnstadiet, apné og hypopné ble skåret i henhold til American Academy of Sleep Medicine manual 2.3.

   HBI (hypoksibelastningsindeksen) ble beregnet som det integrerte området under desaturasjonskurven delt på TST. Arealet under demetningskurven ble oppnådd ved å beregne integralet av oksygenmetningsreduksjonen under 90 % og tilsvarende tid. Høyere HBI-verdier er relatert til en høyere hypoksisk belastning (varighet og grad). Beregninger ble utført med MATLAB 2016 for Windows (The Mathworks, Inc., Natick, USA). Spesifikke metoder viser til vår forrige rapport.

4. Blodtrykksmåling og prøvetaking Blodtrykket ble målt før du sovnet og umiddelbart etter oppvåkning. Avføringsprøver på 1-3 g ble samlet inn fra pasientene om morgenen neste dag og umiddelbart frosset ned i et -80 ℃ kjøleskap av forskeren for senere bruk.

5. Informasjonsinnsamling, inntasting og deltakergruppering. Påmeldingsnummeret, kjønn, alder, høyde, vekt, Epworth-søvnskala (ESS), HT og medisiner, andre viktige medisinske og personlige historier til alle deltakerne i spørreskjemaet, og PSG-rapportparameterne, hovedsakelig AHI, ble samlet og lagt inn i et elektronisk skjema.

   Deltakerne ble delt inn i fire grupper etter om de hadde en bekreftet diagnose av essensiell HT og OSA (AHI ≥15 slag/t (International Classification of Sleep Disorders (3. utgave), som følger). Personer uten OSA og HT tilhørte gruppen OSA0HT0; individer med både OSA og HT var i gruppen OSA1HT1; individer uten OSA men med HT var i gruppen OSA0HT1; og individer med OSA men uten HT var i gruppen OSA1HT0.

6. 16S rRNA-sekvenseringsanalyse av tarmmikrobiomets DNA-ekstraksjon og sekvensering av 16S rRNA-kodende gener ble utført på alle fekale prøver. Denne delen av eksperimentet og analysen ble utført ved Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd. (Beijing, Kina).

7. Fekal analyse 7.1. Ekstraksjon av genom-DNA Totalt genomisk DNA fra humane fekale prøver ble ekstrahert ved bruk av cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB)/natriumdodecylsulfonat (SDS), i henhold til produsentens instruksjoner. DNA-konsentrasjon og renhet ble overvåket på 1 % agarosegeler.

   7.2. Amplikongenerering 16S rRNA/18S rRNA/ITS-gener fra distinkte regioner (16S V4/16S V3/16S V3-V4/16S V4-V5, 18S V4/18S V9, ITS1/ITS2 og Arc V4) ble amplifisert ved bruk av spesifikke primere ( for eksempel 16S V4: 515F-806R, 18S V4: 528F-706R, 18S V9: 1380F-1510R, et. al) med en strekkode. Alle polymerasekjedereaksjoner (PCR) ble utført ved bruk av Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix (New England, Biolabs).

   7.3. Blanding og rensing av polymerasekjedereaksjonsprodukter Bland samme volum av 1X lastebuffer (inneholdt SYB-grønn) med PCR-produkter og utfør elektroforese på 2 % agarosegel for påvisning. PCR-produkter ble blandet i likedensitetsforhold. Deretter ble blanding av PCR-produkter renset med GeneJETTM Gel Extraction Kit (Thermo Scientific).

   7.4. Bibliotekforberedelse og sekvensering Sekvenseringsbiblioteker ble generert ved bruk av Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns (Thermo Scientific), i henhold til produsentens anbefalinger. Bibliotekets kvalitet ble vurdert på et fluorometer (Qubit 2.0; Thermo Scientific). Til slutt ble biblioteket sekvensert på en Ion S5TM XL-plattform og 400 bp/600 bp single-end reads ble generert.

8. Bioinformatikk og statistisk analyse 8.1. Enkeltende lesemontering og kvalitetskontroll 8.1.1 Datadeling Enkeltende-avlesninger ble tildelt prøver basert på deres unike strekkode og avkortet ved å kutte av strekkoden og primersekvensen.

8.1.2 Datafiltrering Kvalitetsfiltrering på råavlesningene ble utført under spesifikke filtreringsforhold for å oppnå rene avlesninger av høy kvalitet i henhold til Cutadapt（V1.9.1）kvalitetskontrollert prosess.

8.1.3 Fjerning av kimærer Lesingene ble sammenlignet med referansedatabasen (Gold-databasen), ved å bruke UCHIME-algoritmen for å oppdage kimære sekvenser, som deretter ble fjernet. Da ble de effektive taggene endelig oppnådd.

8.2. Operasjonell taksonomisk enhetsklynger og artsannotering 8.2.1 Produksjon av operasjonell taksonomisk enhet Sekvensanalyser ble utført av Uparse-programvare (Uparse v7.0.1001). Sekvenser med ≥97% likhet ble tildelt samme operasjonelle taksonomiske enheter (OTUs). En representativ sekvens av hver OTU ble screenet for ytterligere merknader.

8.2.2 Artsannotering For hver representativ sekvens ble Silva-databasen brukt basert på RDP-klassifiseringsalgoritme (versjon 2.2) for å kommentere taksonomisk informasjon.

8.2.3 Fylogenetisk forhold Konstruksjon For å studere det fylogenetiske forholdet mellom forskjellige OTUer, og forskjellen mellom de dominerende artene i forskjellige prøver (grupper), ble flere sekvensjusteringer utført ved bruk av multippelsekvenssammenligning med log-forventning (MUSCLE) programvare ( Versjon 3.8.31).

8.2.4 Datanormalisering OTU-overflodsinformasjon ble normalisert ved å bruke standard sekvensnumre som tilsvarer prøven med minst sekvenser. Påfølgende analyse av alfa-diversitet og beta-diversitet ble alle utført basert på disse utgangsnormaliserte dataene. Chao1-, Shannon- og Simpson-indeksene ble beregnet for å estimere alfa-diversitet og hovedkoordinatanalyse (PCoA) ble brukt for å representere beta-diversitet.

8.3. Alfa-mangfold Alfa-diversitet ble brukt for å analysere kompleksiteten til artsmangfoldet i en prøve gjennom seks indekser, inkludert observerte arter, Chao1, Shannon, Simpson, ACE, Good-coverage. Alle disse indeksene ble beregnet med QIIME (versjon 1.7.0) og vist ved hjelp av R-programvaren (versjon 2.15.3). Chao1 og ACE ble valgt for å identifisere fellesskapsrikdom. Shannon- og Simpson-indekser ble brukt for å identifisere samfunnsmangfoldet.

8.4. Beta-mangfold Beta-mangfoldsanalyse ble brukt for å evaluere forskjellene mellom prøver i artskompleksitet. Beta-diversitet på både vektede og uvektede unifraksjoner ble beregnet av QIIME-programvare (versjon 1.7.0). PCoA ble brukt for å representere Beta-mangfold.