Vliv spánkové apnoe a hypertenze na střevní mikrobiom

1. Účastníci Do studie byli zahrnuti účastníci, kteří podstoupili noční polysomnografii (PSG) ve spánkové laboratoři Pekingské univerzity First Hospital od července 2017 do listopadu 2017. Tato studie byla schválena etickou komisí Pekingské univerzitní první nemocnice. Studie se držela Helsinské deklarace a byla zachována důvěrnost pacientů. Všichni účastníci podepsali formulář informovaného souhlasu. Kritéria pro zařazení byla následující: (1) věk 18 let nebo starší; (2) ambulantní a hospitalizovaní pacienti, kteří podstoupili studii PSG na chrápání; (3) ti, kteří se dobrovolně zúčastnili této studie a podepsali informovaný souhlas. Kritéria vyloučení byla: (1) pacienti, kteří byli před zařazením léčeni pro OSA (pravidelná terapie CPAP, orální aparáty, maxilofaciální chirurgie atd.); (2) pacienti se sekundární HT s jasnou primární příčinou; (3) osoby s anamnézou dyspeptického onemocnění (anamnéza gastrointestinální chirurgie, peptický vřed, zánětlivé onemocnění střev, chronická pankreatitida atd.); (4) ti, kteří měli orgánovou insuficienci, dostávali imunitní látky nebo glukózu; (5) ti, kteří byli v posledních 2 měsících léčeni antibiotiky nebo užívali probiotické produkty (jogurt, mléko, sýr atd.) nepřetržitě (denně) po dobu posledních 2 měsíců. (6) Závislost na alkoholu nebo drogách.
2. Dotazníkové šetření Byl použit jednotně navržený dotazník obsahující otázky týkající se obecných informací, předchozí anamnézy HT, ischemické choroby srdeční, diabetes mellitus, nedávné infekce, medikace, kouření a pití v anamnéze a stravovacích návyků.

3. Hodnocení obstrukční spánkové apnoe a výpočet HBI Pacienti podstupovali pravidelné noční PSG (Compumedics, E-Series). Standardní PSG bylo provedeno podle příručky American Academy of Sleep Medicine (AASM)[11]; tedy šest elektroencefalografických (EEG) kanálů (C3-M2, C4-M1, F3-M2, F4-M1, O1-M2, O2-M1), dva elektrookulografické kanály (E1-M2, E1-M2), elektromyografie brady (EMG1-EMG2, EMG1-EMG3), elektrokardiografie, dýchání (nosní tlak, proudění vzduchu), SpO2, pohyby břicha a hrudníku a pohyby nohou.

   Spánková stádia byla rozdělena do tří non-REM (N1, N2, N3), REM (R) a bdělých (W) stádií. Respirační příhody zahrnovaly obstrukční apnoe, centrální apnoe, smíšenou apnoe a hypopnoe. Byl vypočten index apnoe a hypopnoe (AHI) (součet počtu událostí apnoe a hypopnoe za hodinu). Spánkové stadium, apnoe a hypopnoe byly hodnoceny podle příručky 2.3 Americké akademie spánkové medicíny.

   HBI (index zátěže hypoxií) byl vypočten jako integrální plocha pod křivkou desaturace dělená TST. Plocha pod desaturační křivkou byla získána výpočtem integrálu snížení saturace kyslíkem pod 90 % a odpovídajícího času. Vyšší hodnoty HBI souvisí s vyšší hypoxickou zátěží (dobou trvání a stupněm). Výpočty byly provedeny pomocí MATLABu 2016 pro Windows (The Mathworks, Inc., Natick, USA). Konkrétní metody jsou uvedeny v naší předchozí zprávě.

4. Měření krevního tlaku a odběr vzorků Krevní tlak byl měřen před spaním a bezprostředně po probuzení. Vzorky stolice o hmotnosti 1-3 g byly odebrány pacientům ráno následujícího dne a výzkumník okamžitě zmrazil v chladničce -80 °C pro pozdější použití.

5. Sběr informací, vstup a seskupení účastníků. Bylo sestaveno a zadáno registrační číslo, pohlaví, věk, výška, hmotnost, Epworthova spánková škála (ESS), HT a léky, další hlavní zdravotní a osobní historie všech účastníků dotazníku a parametry zprávy PSG, zejména AHI. elektronický formulář.

   Účastníci byli rozděleni do čtyř skupin podle toho, zda měli potvrzenou diagnózu esenciální HT a OSA (AHI ≥15 tepů/h (International Classification of Sleep Disorders (3. vydání), následovně). Jedinci bez OSA a HT patřili do skupiny OSA0HT0; jedinci s OSA i HT byli ve skupině OSA1HT1; jedinci bez OSA, ale s HT byli ve skupině OSA0HT1; a jedinci s OSA, ale bez HT byli ve skupině OSA1HT0.

6. Analýza sekvenování 16S rRNA střevního mikrobiomu Extrakce DNA a sekvenování genů kódujících 16S rRNA byly provedeny u všech vzorků stolice. Tato část experimentu a analýzy byla provedena ve společnosti Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd. (Peking, Čína).

7. Fekální analýza 7.1. Extrakce genomové DNA Celková genomová DNA z lidských fekálních vzorků byla extrahována pomocí cetyltrimethylamonium bromidu (CTAB)/dodecylsulfonátu sodného (SDS) podle pokynů výrobce. Koncentrace a čistota DNA byla sledována na 1% agarózových gelech.

   7.2. Generace amplikonu 16S rRNA/18S rRNA/ITS geny odlišných oblastí (16S V4/16S V3/16S V3-V4/16S V4-V5, 18S V4/18S V9, ITS1/ITS2 a Arc V4) byly amplifikovány pomocí specifických primerů ( například 16S V4: 515F-806R, 18S V4: 528F-706R, 18S V9: 1380F-1510R, et. al) s čárovým kódem. Všechny polymerázové řetězové reakce (PCR) byly provedeny pomocí Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix (New England, Biolabs).

   7.3. Míchání a čištění produktů polymerázové řetězové reakce Smíchejte stejný objem 1X nanášecího pufru (obsahujícího SYB zelený) s produkty PCR a proveďte elektroforézu na 2% agarózovém gelu pro detekci. Produkty PCR byly smíchány v poměrech ekvidenzity. Poté byla směs PCR produktů purifikována pomocí GeneJETTM Gel Extraction Kit (Thermo Scientific).

   7.4. Příprava a sekvenování knihovny Sekvenační knihovny byly vytvořeny pomocí sady Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns (Thermo Scientific) podle doporučení výrobce. Kvalita knihovny byla hodnocena na fluorometru (Qubit 2.0; Thermo Scientific). Nakonec byla knihovna sekvenována na platformě Ion S5TM XL a byla generována jednokoncová čtení 400 bp/600 bp.

8. Bioinformatika a statistická analýza 8.1. Montáž a kontrola kvality jednokoncových odečtů 8.1.1 Rozdělení dat Jednokoncové čtení bylo přiřazeno vzorkům na základě jejich jedinečného čárového kódu a zkráceno odříznutím čárového kódu a sekvence primeru.

8.1.2 Filtrace dat Filtrování kvality na nezpracovaných odečtech bylo provedeno za specifických podmínek filtrování, aby se získaly vysoce kvalitní čisté odečty podle procesu s kontrolou kvality Cutadapt（V1.9.1）.

8.1.3 Odstranění chiméry Načtené hodnoty byly porovnány s referenční databází (Zlatá databáze) pomocí algoritmu UCHIME k detekci chimérických sekvencí, které byly poté odstraněny. Poté byly konečně získány efektivní značky.

8.2. Shlukování provozních taxonomických jednotek a anotace druhů 8.2.1 Produkce provozních taxonomických jednotek Analýzy sekvencí byly provedeny pomocí softwaru Uparse (Uparse v7.0.1001). Sekvence s ≥97% podobností byly přiřazeny stejným operačním taxonomickým jednotkám (OTU). Reprezentativní sekvence každé OTU byla skrínována pro další anotaci.

8.2.2 Anotace druhů Pro každou reprezentativní sekvenci byla k anotaci taxonomických informací použita databáze Silva založená na algoritmu klasifikátoru RDP (verze 2.2).

8.2.3 Konstrukce fylogenetického vztahu Aby bylo možné studovat fylogenetický vztah mezi různými OTU a rozdíl mezi dominantními druhy v různých vzorcích (skupinách), bylo provedeno vícenásobné zarovnání sekvencí pomocí softwaru vícenásobného sekvenčního porovnání pomocí logačekání (MUSCLE) ( Verze 3.8.31).

8.2.4 Normalizace dat Informace o množství OTU byly normalizovány pomocí standardních čísel sekvencí odpovídajících vzorku s nejmenším počtem sekvencí. Následná analýza diverzity alfa a diverzity beta byla provedena na základě těchto výstupních normalizovaných dat. Pro odhad diverzity alfa byly vypočteny indexy Chao1, Shannon a Simpson a k reprezentaci diverzity beta byla použita hlavní souřadnicová analýza (PCoA).

8.3. Alfa diverzita Alfa diverzita byla použita k analýze složitosti druhové diverzity ve vzorku prostřednictvím šesti indexů, včetně pozorovaných druhů, Chao1, Shannon, Simpson, ACE, Good-coverage. Všechny tyto indexy byly vypočteny pomocí QIIME (verze 1.7.0) a zobrazeny pomocí softwaru R (verze 2.15.3). Chao1 a ACE byly vybrány k identifikaci bohatství komunity. K identifikaci diverzity komunity byly použity indexy Shannon a Simpson.

8.4. Beta diverzita K vyhodnocení rozdílů vzorků v druhové komplexitě byla použita beta analýza diverzity. Beta diverzita na vážených i nevážených unifrakcích byla vypočtena pomocí softwaru QIIME (verze 1.7.0). PCoA byl použit k reprezentaci beta diverzity.