Влияние апноэ во сне и гипертонии на микробиом кишечника

1. Участники В исследование были включены участники, прошедшие ночную полисомнографию (ПСГ) в лаборатории сна Первой больницы Пекинского университета с июля 2017 года по ноябрь 2017 года. Это исследование было одобрено комитетом по этике Первой больницы Пекинского университета. Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией, и сохранялась конфиденциальность пациентов. Все участники подписали форму информированного согласия. Критерии включения были следующими: (1) возраст 18 лет и старше; (2) амбулаторные и стационарные пациенты, прошедшие ПСГ-исследование по поводу храпа; (3) те, кто вызвался участвовать в этом исследовании и подписал форму информированного согласия. Критериями исключения были: (1) пациенты, получавшие лечение по поводу СОАС (регулярная СИПАП-терапия, протезирование полости рта, челюстно-лицевая хирургия и т. д.) до включения в исследование; (2) пациенты с вторичной АГ с четкой первичной причиной; (3) имеющие в анамнезе диспепсические заболевания (в анамнезе операции на желудочно-кишечном тракте, язвенная болезнь, воспалительные заболевания кишечника, хронический панкреатит и др.); (4) те, у кого была органная недостаточность, получали иммунные препараты или глюкозу; (5) те, кто получал лечение антибиотиками в течение последних 2 месяцев или принимал пробиотические продукты (йогурт, молоко, сыр и т. д.) постоянно (ежедневно) в течение последних 2 месяцев. (6) Алкогольная или наркотическая зависимость.
2. Анкетный опрос Был использован унифицированный опросный лист, включающий вопросы, касающиеся общей информации, предыдущей истории ГТ, ишемической болезни сердца, сахарного диабета, недавней истории инфекции, приема лекарств, курения и употребления алкоголя в анамнезе, а также диетических привычек.

3. Оценка обструктивного апноэ сна и расчет HBI Пациентам регулярно проводилась ночная полисомнография (Compumedics, E-Series). Стандартная полисомнография проводилась в соответствии с руководством Американской академии медицины сна (AASM) [11]; шесть каналов электроэнцефалографии (ЭЭГ) (C3-M2, C4-M1, F3-M2, F4-M1, O1-M2, O2-M1), два канала электроокулографии (E1-M2, E1-M2), электромиография подбородка (ЭМГ1-ЭМГ2, ЭМГ1-ЭМГ3), регистрировали электрокардиографию, дыхание (носовое давление, поток воздуха), SpO2, движения живота и грудной клетки, движения ног.

   Стадии сна были разделены на три фазы без БДГ (N1, N2, N3), фазы БДГ (R) и стадии бодрствования (W). Респираторные явления включали обструктивное апноэ, центральное апноэ, смешанное апноэ и гипопноэ. Рассчитывали индекс апноэ и гипопноэ (ИАГ) (сумма числа эпизодов апноэ и гипопноэ в час). Стадия сна, эпизоды апноэ и гипопноэ оценивались в соответствии с руководством 2.3 Американской академии медицины сна.

   HBI (индекс бремени гипоксии) рассчитывали как интегральную площадь под кривой десатурации, деленную на TST. Площадь под кривой десатурации была получена путем вычисления интеграла снижения насыщения кислородом ниже 90% и соответствующего времени. Более высокие значения HBI связаны с более высокой гипоксической нагрузкой (продолжительность и степень). Расчеты выполнены в программе MATLAB 2016 для Windows (The Mathworks, Inc., Натик, США). Конкретные методы относятся к нашему предыдущему отчету.

4. Измерение артериального давления и сбор образцов Артериальное давление измеряли перед сном и сразу после пробуждения. Образцы кала весом 1-3 г были собраны у пациентов утром следующего дня и немедленно заморожены исследователем в холодильнике при температуре -80 ℃ для последующего использования.

5. Сбор информации, ввод и группировка участников. Регистрационный номер, пол, возраст, рост, вес, шкала сна Эпворта (ESS), ГТ и прием лекарств, другие основные медицинские и личные истории всех участников анкеты, а также параметры отчета ПСГ, в основном AHI, были собраны и введены в электронную форму.

   Участники были разделены на четыре группы в зависимости от наличия у них подтвержденного диагноза эссенциальной АГ и СОАС (ИАГ ≥15 уд/ч (Международная классификация расстройств сна (3-е издание)), как указано ниже. Лица без ОАС и АГ относились к группе ОСА0НТ0; лица с OSA и HT были в группе OSA1HT1; лица без СОАС, но с АГ - в группе СОАС0НТ1; а лица с СОАС, но без АГ были в группе СОАС1НТ0.

6. Анализ секвенирования 16S рРНК выделения ДНК кишечного микробиома и секвенирование генов, кодирующих 16S рРНК, были выполнены для всех образцов фекалий. Эта часть эксперимента и анализа была проведена в Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd. (Пекин, Китай).

7. Анализ кала 7.1. Выделение геномной ДНК Полную геномную ДНК из образцов фекалий человека экстрагировали с использованием цетилтриметиламмонийбромида (CTAB)/додецилсульфоната натрия (SDS) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию и чистоту ДНК контролировали на 1% агарозных гелях.

   7.2. Генерация ампликона Гены 16S рРНК/18S рРНК/ITS различных областей (16S V4/16S V3/16S V3-V4/16S V4-V5, 18S V4/18S V9, ITS1/ITS2 и Arc V4) амплифицировали с использованием специфических праймеров ( например 16S V4: 515F-806R, 18S V4: 528F-706R, 18S V9: 1380F-1510R и т.д. al) со штрих-кодом. Все полимеразные цепные реакции (ПЦР) проводили с использованием Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix (New England, Biolabs).

   7.3. Смешивание и очистка продуктов полимеразной цепной реакции Смешайте тот же объем 1X загрузочного буфера (содержащего SYB green) с продуктами ПЦР и проведите электрофорез на 2% агарозном геле для обнаружения. Продукты ПЦР смешивали в равных пропорциях. Затем смесь продуктов ПЦР очищали с помощью набора для гель-экстракции GeneJETTM (Thermo Scientific).

   7.4. Подготовка библиотеки и секвенирование Библиотеки секвенирования были созданы с использованием набора Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns (Thermo Scientific) в соответствии с рекомендациями производителя. Качество библиотеки оценивали на флуорометре (Qubit 2.0; Thermo Scientific). Наконец, библиотеку секвенировали на платформе Ion S5TM XL и генерировали односторонние чтения 400 п.н./600 п.н.

8. Биоинформатика и статистический анализ 8.1. Сборка односторонних ридов и контроль качества 8.1.1 Разделение данных Односторонние чтения были назначены образцам на основе их уникального штрих-кода и усечены путем вырезания последовательности штрих-кода и праймера.

8.1.2 Фильтрация данных Качественная фильтрация необработанных считываний выполнялась при определенных условиях фильтрации для получения высококачественных чистых считываний в соответствии с процессом контроля качества Cutadapt (V1.9.1).

8.1.3 Удаление химер Чтения сравнивали с эталонной базой данных (база данных Gold) с использованием алгоритма UCHIME для обнаружения химерных последовательностей, которые затем удаляли. Затем, наконец, были получены эффективные теги.

8.2. Оперативная кластеризация таксономических единиц и аннотация видов 8.2.1 Производство операционных таксономических единиц Анализ последовательностей выполнялся с помощью программного обеспечения Uparse (Uparse v7.0.1001). Последовательности со сходством ≥97% были отнесены к одним и тем же операционным таксономическим единицам (OTU). Репрезентативная последовательность каждой OTU была проверена для дальнейшей аннотации.

8.2.2 Аннотации видов Для каждой репрезентативной последовательности использовалась база данных Silva на основе алгоритма классификатора RDP (версия 2.2) для аннотирования таксономической информации.

8.2.3 Построение филогенетических взаимоотношений Для изучения филогенетических взаимоотношений между различными OTU и различия доминирующих видов в разных образцах (группах) было проведено множественное выравнивание последовательностей с использованием программного обеспечения для множественного сравнения последовательностей с помощью логарифмического ожидания (MUSCLE) ( Версия 3.8.31).

8.2.4 Нормализация данных Информация об изобилии OTU была нормализована с использованием стандартных порядковых номеров, соответствующих образцу с наименьшим количеством последовательностей. Последующий анализ альфа-разнообразия и бета-разнообразия был выполнен на основе этих выходных нормализованных данных. Индексы Chao1, Shannon и Simpson были рассчитаны для оценки альфа-разнообразия, а анализ основных координат (PCoA) использовался для представления бета-разнообразия.

8.3. Альфа-разнообразие Альфа-разнообразие применялось для анализа сложности видового разнообразия в выборке с помощью шести индексов, включая наблюдаемые виды, Chao1, Shannon, Simpson, ACE, Good-coverage. Все эти индексы были рассчитаны с помощью QIIME (версия 1.7.0) и отображены с помощью программного обеспечения R (версия 2.15.3). Chao1 и ACE были выбраны для определения богатства сообщества. Для определения разнообразия сообщества использовались индексы Шеннона и Симпсона.

8.4. Бета-разнообразие Анализ бета-разнообразия использовался для оценки различий образцов по видовой сложности. Бета-разнообразие как на взвешенных, так и на невзвешенных однократных фракциях рассчитывали с помощью программного обеспечения QIIME (версия 1.7.0). PCoA использовался для представления бета-разнообразия.