髓系来源抑制性细胞在原发性骨髓纤维化中的作用

原发性骨髓纤维化（PMF）是一种费城染色体阴性的慢性骨髓增殖性疾病，其特征包括：恶性造血干细胞CD34+的克隆性扩增、骨髓纤维化、脾肿大、髓外造血以及骨髓和脾脏中广泛的新生血管生成。 95%的患者存在JAK2、CALR或MPL基因的获得性突变，导致髓系谱系中JAK-STAT通路的激活。 目前认为炎症在PMF的发病机制中起重要作用，这一点通过具有预后意义的炎性细胞因子高水平以及伴有活性氧（ROS）升高的慢性氧化应激状态得以证实。

髓源性抑制细胞（MDSCs）是在恶性肿瘤、脓毒症或慢性炎症患者中积累的未成熟髓系细胞。 在稳态下，MDSCs从骨髓迁移到不同的外周器官，在那里分化为巨噬细胞、树突状细胞或粒细胞。 肿瘤微环境中产生的细胞因子和趋化因子将未成熟髓系细胞招募到外周血、脾脏、肝脏和淋巴器官，阻止其分化（通过激活STAT3信号通路），并诱导其活化为MDSCs。 该细胞群体通常分为两个亚群：多形核（PMN）-MDSCs和单核（M）-MDSCs。 此外，MDSCs具有很强的能力来降低T/NK细胞的细胞毒功能，并具有分化为内皮细胞并整合到肿瘤血管内皮中的潜力，从而促进肿瘤新生血管生成。 最后，Wang等人发现骨髓增殖性肿瘤患者中循环MDSCs水平较高，这些细胞能够抑制T细胞增殖。

这些前提表明，MDSCs可能通过抑制免疫细胞的某些功能、滋养该疾病特征的慢性炎症和/或促进血管生成过程，在PMF的发病机制中发挥作用。

慢性炎症状态通常与MDSCs（数量和活性）的增加有关，后者通过产生ROS诱导氧化应激，从而有助于维持和加剧炎症。 在PMF患者中，炎症被认为在该疾病的发病机制中起重要作用，这一点通过具有预后意义的炎性细胞因子高水平以及慢性氧化应激状态得以证实。 几年前，Wang等人在数量非常有限的PMF患者中报告了循环MDSCs频率的增加；然而，他们可能由于样本量小，未能发现MDSCs数量与遗传背景及疾病表型之间的任何相关性。

本项目的基本原理源于以下观察：在PMF中，存在所有有利于MDSCs在疾病发病机制中发挥作用的前提：a) 慢性炎症状态，b) 免疫系统不同程度的功能障碍（与驱动突变导致的JAK/STAT通路激活一起，可能是疾病进展的原因），以及c) 广泛的新生血管生成过程。

基于这些考虑，研究者假设：1) MDSCs数量和/或功能的增加参与了PMF患者中描述的免疫功能障碍；2) MDSCs凭借其获得内皮表型和功能的能力，有助于脾脏和骨髓的新生血管生成；3) MDSCs通过其产生ROS的能力，进而在细胞水平上造成氧化应激，有助于维持炎症；4) JAK抑制剂疗法（目前最有效的减轻脾肿大和消除PMF全身症状的对症药物）不仅通过下调患者造血细胞中的JAK/STAT通路发挥其有益作用，还通过抑制MDSCs中的ROS产生发挥作用。

本项目的意义在于：

i) 识别一种新的发病机制，该机制与DNA突变一起并作为其补充，有助于解释PMF临床病程中观察到的表型多样性；ii) 为PMF的个性化治疗确定一个新的靶点。

本项目的主要目标是研究MDSCs在加剧慢性炎症中的作用（通过分析细胞因子/趋化因子及其受体），评估其百分比与临床/生物学参数的相关性，研究JAK抑制剂（JAK-i）治疗后的变化，并测试它们在新血管生成过程中的参与。

主要终点：

• 在PMF患者和健康受试者的外周血和骨髓中，从表型和功能上表征MDSCs亚群（多形核（PMN）-MDSCs和单核（M）-MDSCs）。 在脾切除的情况下，我们将评估从患者（因治疗原因接受该手术）和对照组（因创伤性损伤接受脾切除术后）新鲜获得的脾源性单个核细胞中PMN-MDSCs和M-MDSCs的存在。
• 将这些数据与PMF患者的临床和生物学参数以及JAK2、MPL和CALR基因驱动突变的基因型相关联。
• 在PMF患者和对照组的血浆样本中，评估参与炎症过程、免疫抑制功能、血管生成活性和MDSCs产生增加的细胞因子。

次要终点是：

1. 研究在促血管生成条件下培养的患者来源的MDSCs，是否能够在血管生成培养条件下分化为内皮细胞（流式细胞术）和/或改变其基因表达谱（通过实时定量PCR（RT-qPCR）在孵育前、后进行）；
2. 体外验证MDSCs参与PMF特征的新血管生成过程的假设，评估PMF组织中内皮样MDSCs的存在，对脾脏和骨髓切片进行免疫荧光染色，并通过共聚焦显微镜分析；
3. 验证MDSCs是否是JAK抑制剂药物的有效靶点，通过流式细胞术、RT-qPCR、ELISA测试在体外测试JAK1/JAK2抑制剂对MDSC活性和功能的影响。