Rollen til myeloid-avledede suppressor-celler i primær myelofibrose

Primær myelofibrose (PMF) er en Philadelphia-negativ kronisk myeloproliferativ lidelse preget av: klonal ekspansjon av en malign hematopoietisk stamcelle CD34+, beinmargsfibrose, splenomegali, ekstramedullær hematopoese og omfattende neoangiogenese i beinmarg og milt. Nittifem % av pasientene har en ervervet mutasjon i JAK2-, CALR- eller MPL-genene som fører til en aktivering av JAK-STAT-veien i den myeloide linjen. Inflammasjon antas nå å spille en relevant rolle i PMF-patogenesen, som bevist av høye nivåer av inflammatoriske cytokiner med prognostisk betydning og av en tilstand av kronisk oksidativ stress med forhøyede reaktive oksygenarter (ROS).

Myeloideavledede suppressorceller (MDSCer) er umodne myeloide celler som akkumuleres hos pasienter med maligniteter, sepsis eller kronisk inflammasjon. I stabil tilstand migrerer MDSCer fra beinmargen til forskjellige perifere organer, der de differensierer seg til makrofager, dendrittiske celler eller granulocytter. Cytokiner og kjemokiner som produseres i tumormikromiljøet rekrutterer umodne myeloide celler i perifert blod (PB), milt, lever og lymfoide organer, hindrer deres differensiering (gjennom aktivering av STAT3-signalveien) og induserer deres aktivering til MDSCer. Denne cellepopulasjonen er konvensjonelt delt i to undergrupper: polymorfonukleære (PMN)- og monocytære (M)-MDSCer. Dessuten har MDSCer en sterk evne til å redusere de cytotoksiske funksjonene til T-/NK-celler og potensialet til å differensiere seg til endotelceller og inkorporeres i tumorendoteliet, noe som fremmer tumorneoangiogenese. Til slutt fant Wang et al. høye nivåer av sirkulerende MDSCer hos pasienter med myeloproliferative neoplasi som var i stand til å hemme T-celleproliferasjon.

Disse premissene antyder at MDSCer kan ha en rolle i patogenesen til PMF ved å hemme noen funksjoner av immunceller, nære kronisk inflammasjon som karakteriserer sykdommen og/eller stimulere angiogeneseprosessen.

En tilstand av kronisk inflammasjon er vanligvis assosiert med en økning av MDSCer (antall og aktivitet) som bidrar til å opprettholde og drive inflammasjon gjennom induksjon av oksidativ stress ved hjelp av ROS-produksjon. Hos PMF-pasienter antas inflammasjon å spille en relevant rolle i sykdommens patogenese, som bevist av høye nivåer av inflammatoriske cytokiner med prognostisk betydning og av en tilstand av kronisk oksidativ stress. For noen år siden rapporterte Wang et al. i et svært begrenset antall pasienter med PMF en økning i frekvensen av sirkulerende MDSCer; de var imidlertid ikke i stand, sannsynligvis på grunn av den lille størrelsen på prøvene, til å finne noen korrelasjon mellom antallet MDSCer og både den genetiske bakgrunnen og sykdomsphenotypen.

Rasjonale for dette prosjektet stammer fra observasjonene at i PMF eksisterer alle premissene som favoriserer en rolle for MDSCer i sykdommens patogenese: a) en tilstand av kronisk inflammasjon, b) en varierende grad av dysfunksjon i immunsystemet (som, sammen med aktivering av JAK/STAT-veien på grunn av drivermutasjoner, kan være ansvarlig for sykdomsprogresjon), og c) omfattende neoangiogene prosesser.

Basert på disse betraktningene, hypotetiserer forskerne at: 1) en økning i antall og/eller funksjon av MDSCer er involvert i den immunologiske dysfunksjonen som er beskrevet hos PMF-pasienter, 2) MDSCer, takket være deres evne til å oppnå en endotel fenotype og funksjon, bidrar til splenisk og marg neoangiogenese, 3) MDSCer bidrar til opprettholdelsen av inflammasjon gjennom deres kapasitet til å produsere ROS og dermed oksidativ stress på cellulært nivå, 4) JAK-hemmende terapi (for tiden det mest effektive symptomatiske legemiddelet for å redusere splenomegali og avskaffe systemiske symptomer i PMF) utøver sin gunstige effekt ikke bare ved å nedregulere JAK/STAT-veien i hematopoietiske celler hos pasienter, men også ved å hemme ROS-produksjon i MDSCer.

Betydningen av prosjektet ligger:

i) i anerkjennelsen av en ny patogenetisk mekanisme som, sammen med og i tillegg til DNA-mutasjon, bidrar til å forklare den fenotypiske diversiteten som observeres under den kliniske forløpet av PMF; ii) i identifikasjonen av et nytt mål for personalisert behandling av PMF.

Det primære målet med dette prosjektet er å undersøke rollen til MDSCer i å drive kronisk inflammasjon (gjennom analyse av cytokiner/kjemokiner sammen med deres reseptorer), å evaluere deres prosentandel i korrelasjon med kliniske/biologiske parametre, å studere modifikasjoner etter behandling med JAK-hemmere (JAK-i), å teste deres deltakelse i den neoangiogene prosessen.

Primære endepunkter:

• å karakterisere, fenotypisk og funksjonelt, MDSC-undergrupper (polymorfonukleære (PMN)- og monocytære (M)-MDSCer) i PB og BM hos PMF-pasienter og friske individer. I tilfelle splenektomi vil vi evaluere tilstedeværelsen av PMN-MDSCer og M-MDSCer i miltavledede mononukleære celler ferskt innhentet fra pasienter (som gjennomgår prosedyren av terapeutiske årsaker) og kontroller (etter splenektomi for traumatiske lesjoner).
• å korrelere dataene med kliniske og biologiske parametre samt med genotypen av drivermutasjoner i JAK2-, MPL- og CALR-genene hos PMF-pasienter.
• å vurdere, i plasmaprøver fra PMF og kontroller, cytokiner involvert i inflammasjonsprosessen, i den immunsuppressive funksjonen, i den angiogene aktiviteten og i den økte produksjonen av MDSCer.

Sekundære endepunkter er:

1. undersøke om pasientavledede MDSCer, dyrket i proangiogene forhold, er i stand til å differensiere seg til endotelceller i angiogene dyrkingsforhold (flowcytometri) og/eller å endre sin genuttrykksprofil (ved RealTime-kvantitativ PCR (RT-qPCR) før-, etter- inkubasjon);
2. teste ex vivo hypotesen om at MDSCer er involvert i de neoangiogene prosessene som karakteriserer PMF, ved å evaluere tilstedeværelsen av endotellignende MDSCer i PMF-vev, utføre immunofluorescensfarging i milt- og BM-seksjoner og analysere dem ved konfokal mikroskopi;
3. verifisere om MDSCer er effektive mål for JAK-hemmerlegemidler, ved å teste in vitro effektene av JAK1/JAK2-hemmere på MDSC-aktivitet og -funksjon ved flowcytometri, RT-qPCR, ELISA-tester.