Роль миелоидных супрессорных клеток при первичном миелофиброзе

Первичный миелофиброз (ПМФ) – это филадельфия-негативное хроническое миелопролиферативное заболевание, характеризующееся: клональной экспансией злокачественной гемопоэтической стволовой клетки CD34+, фиброзом костного мозга (КМ), спленомегалией, экстрамедуллярным гемопоэзом и обширным неоангиогенезом в КМ и селезёнке. У 95% пациентов обнаруживается приобретённая мутация генов JAK2, CALR или MPL, приводящая к активации пути JAK-STAT в миелоидном ростке. В настоящее время считается, что воспаление играет значительную роль в патогенезе ПМФ, что подтверждается высокими уровнями воспалительных цитокинов, имеющих прогностическое значение, и состоянием хронического окислительного стресса с повышенными уровнями активных форм кислорода (АФК).

Миелоидные супрессорные клетки (MDSC) – это незрелые миелоидные клетки, которые накапливаются у пациентов со злокачественными новообразованиями, сепсисом или хроническим воспалением. В нормальных условиях MDSC мигрируют из КМ в различные периферические органы, где дифференцируются в макрофаги, дендритные клетки или гранулоциты. Цитокины и хемокины, вырабатываемые в опухолевом микроокружении, рекрутируют незрелые миелоидные клетки в периферическую кровь (ПК), селезёнку, печень и лимфоидные органы, предотвращают их дифференцировку (через активацию сигнального пути STAT3) и индуцируют их активацию в MDSC. Эта популяция клеток традиционно делится на два подмножества: полиморфонуклеарные (PMN)-MDSC и моноцитарные (M)-MDSC. Кроме того, MDSC обладают выраженной способностью снижать цитотоксические функции T/NK-клеток и потенциалом дифференцироваться в эндотелиальные клетки и включаться в опухолевый эндотелий, способствуя опухолевому неоангиогенезу. Наконец, Wang и соавт. обнаружили высокие уровни циркулирующих MDSC у пациентов с миелопролиферативными новообразованиями, которые были способны ингибировать пролиферацию T-клеток.

Эти предпосылки позволяют предположить, что MDSC могут играть роль в патогенезе ПМФ, ингибируя некоторые функции иммунных клеток, поддерживая хроническое воспаление, характерное для заболевания, и/или усиливая процесс ангиогенеза.

Состояние хронического воспаления обычно ассоциировано с увеличением количества и активности MDSC, что способствует поддержанию и усилению воспаления за счёт индукции окислительного стресса посредством продукции АФК. У пациентов с ПМФ считается, что воспаление играет значительную роль в патогенезе заболевания, что подтверждается высокими уровнями воспалительных цитокинов, имеющих прогностическое значение, и состоянием хронического окислительного стресса. Несколько лет назад Wang и соавт. сообщили об увеличении частоты циркулирующих MDSC у очень ограниченного числа пациентов с ПМФ; однако, вероятно из-за малого размера выборки, им не удалось обнаружить какой-либо корреляции между количеством MDSC и как генетическим фоном, так и фенотипом заболевания.

Обоснование данного проекта основывается на наблюдениях, что при ПМФ существуют все предпосылки, благоприятствующие роли MDSC в патогенезе заболевания: а) состояние хронического воспаления, б) вариабельная степень дисфункции иммунной системы (которая, наряду с активацией пути JAK/STAT из-за драйверных мутаций, может быть ответственной за прогрессирование заболевания) и в) обширные неоангиогенные процессы.

Основываясь на этих соображениях, исследователи выдвигают гипотезу, что: 1) увеличение количества и/или функции MDSC участвует в иммунологической дисфункции, описанной у пациентов с ПМФ; 2) MDSC, благодаря своей способности приобретать эндотелиальный фенотип и функцию, способствуют спленальному и костномозговому неоангиогенезу; 3) MDSC способствуют поддержанию воспаления благодаря своей способности продуцировать АФК и, как следствие, вызывать окислительный стресс на клеточном уровне; 4) терапия JAK-ингибиторами (в настоящее время наиболее эффективный симптоматический препарат для уменьшения спленомегалии и купирования системных симптомов при ПМФ) оказывает своё благотворное действие не только за счёт подавления пути JAK/STAT в гемопоэтических клетках пациентов, но и за счёт ингибирования продукции АФК в MDSC.

Значимость проекта заключается:

i) в распознавании нового патогенетического механизма, который, наряду и в дополнение к мутациям ДНК, способствует объяснению фенотипического разнообразия, наблюдаемого в течение клинического течения ПМФ; ii) в идентификации новой мишени для персонализированного лечения ПМФ.

Основная цель данного проекта – исследовать роль MDSC в поддержании хронического воспаления (посредством анализа цитокинов/хемокинов вместе с их рецепторами), оценить их процентное содержание в корреляции с клинико-биологическими параметрами, изучить изменения после лечения JAK-ингибиторами (JAK-i), проверить их участие в неоангиогенном процессе.

Первичные конечные точки:

• Охарактеризовать фенотипически и функционально подмножества MDSC (полиморфонуклеарные (PMN)-MDSC и моноцитарные (M)-MDSC) в ПК и КМ пациентов с ПМФ и здоровых субъектов. В случае спленэктомии мы оценим наличие PMN-MDSC и M-MDSC в свежеполученных мононуклеарных клетках селезёнки от пациентов (проходящих процедуру по терапевтическим показаниям) и контролей (после спленэктомии по поводу травматических повреждений).
• Скоррелировать полученные данные с клиническими и биологическими параметрами, а также с генотипом драйверных мутаций генов JAK2, MPL и CALR у пациентов с ПМФ.
• Оценить в образцах плазмы от пациентов с ПМФ и контролей цитокины, вовлечённые в воспалительный процесс, иммуносупрессивную функцию, ангиогенную активность и усиленную продукцию MDSC.

Вторичные конечные точки:

1. Исследовать, способны ли MDSC, полученные от пациентов и культивируемые в проангиогенных условиях, дифференцироваться в эндотелиальные клетки в условиях ангиогенной культуры (проточная цитометрия) и/или изменять свой профиль экспрессии генов (с помощью количественной ПЦР в реальном времени (RT-qPCR) до и после инкубации);
2. Проверить ex vivo гипотезу о том, что MDSC вовлечены в неоангиогенные процессы, характеризующие ПМФ, оценивая наличие эндотелий-подобных MDSC в тканях ПМФ, выполняя иммунофлуоресцентное окрашивание срезов селезёнки и КМ и анализируя их с помощью конфокальной микроскопии;
3. Проверить, являются ли MDSC эффективными мишенями для препаратов JAK-ингибиторов, тестируя in vitro эффекты ингибиторов JAK1/JAK2 на активность и функцию MDSC с помощью проточной цитометрии, RT-qPCR, ELISA-тестов.