Rol van Myeloïde-afgeleide Suppressorcellen In Primaire Myelofibrose

Primaire myelofibrose (PMF) is een Philadelphia-negatieve chronische myeloproliferatieve aandoening die wordt gekenmerkt door: clonale expansie van een kwaadaardige hematopoëtische stamcel CD34+, beenmerg (BM) fibrose, splenomegalie, extra-medullaire hematopoëse en uitgebreide neoangiogenese in BM en milt. Vijfennegentig % van de patiënten heeft een verworven mutatie van de JAK2-, CALR- of MPL-genen die een activatie van de JAK-STAT-route in de myeloïde lijn bepaalt. Momenteel wordt gedacht dat ontsteking een relevante rol speelt in de pathogenese van PMF, zoals bewezen door hoge niveaus van inflammatoire cytokinen met prognostische betekenis en door een toestand van chronische oxidatieve stress met verhoogde reactieve zuurstofspecies (ROS).

Myeloïde-afgeleide suppressorcellen (MDSC's) zijn onrijpe myeloïde cellen die zich ophopen bij patiënten met maligniteiten, sepsis of chronische ontsteking. In stabiele toestand migreren MDSC's vanuit het BM naar verschillende perifere organen, waar ze differentiëren in macrofagen, dendritische cellen of granulocyten. Cytokinen en chemokinen die worden geproduceerd in de tumormicro-omgeving recruteren onrijpe myeloïde cellen in perifeer bloed (PB), milt, lever en lymfoïde organen, voorkomen hun differentiatie (door activering van de STAT3-signaalroute) en induceren hun activering tot MDSC's. Deze celpopulatie wordt conventioneel verdeeld in twee subsets: polymorfonucleaire (PMN)- en monocytische (M)-MDSC's. Daarnaast hebben MDSC's het sterke vermogen om cytotoxische functies van T/NK-cellen te verminderen en het potentieel om te differentiëren in endotheelcellen en te integreren in tumorendotheel, wat tumorneoangiogenese bevordert. Ten slotte vonden Wang et al. hoge niveaus van circulerende MDSC's bij patiënten met myeloproliferatieve neoplasieën die in staat waren T-celproliferatie te remmen.

Deze premissen suggereren dat MDSC's een rol zouden kunnen spelen in de pathogenese van PMF door sommige functies van immuuncellen te remmen, de chronische ontsteking die de ziekte kenmerkt te voeden en/of het angiogenese-proces te stimuleren.

Een toestand van chronische ontsteking wordt gewoonlijk geassocieerd met een toename van MDSC's (aantal en activiteit) die bijdraagt aan het handhaven en aanwakkeren van ontsteking door inductie van oxidatieve stress middels ROS-productie. Bij PMF-patiënten wordt gedacht dat ontsteking een relevante rol speelt in de pathogenese van de ziekte, zoals bewezen door hoge niveaus van inflammatoire cytokinen met prognostische betekenis en door een toestand van chronische oxidatieve stress. Enkele jaren geleden rapporteerden Wang et al. in een zeer beperkt aantal patiënten met PMF een toename van de frequentie van circulerende MDSC's; ze waren echter niet in staat, waarschijnlijk vanwege de kleine omvang van de steekproeven, om een correlatie te vinden tussen het aantal MDSC's en zowel de genetische achtergrond als het ziektefenotype.

De onderbouwing van dit project vloeit voort uit de observaties dat bij PMF alle premissen aanwezig zijn die een rol voor MDSC's in de pathogenese van de ziekte begunstigen: a) een status van chronische ontsteking, b) een variabele mate van disfunctie van het immuunsysteem (die, samen met activering van de JAK/STAT-route door driver-mutaties, verantwoordelijk zou kunnen zijn voor ziekteprogressie), en c) uitgebreide neoangiogenetische processen.

Op basis van deze overwegingen veronderstellen de onderzoekers dat: 1) een toename in aantal en/of functie van MDSC's betrokken is bij de immunologische dysfunctie die is beschreven bij PMF-patiënten, 2) MDSC's, dankzij hun vermogen om een endotheelfenotype en -functie te verkrijgen, bijdragen aan splenische en merg-neoangiogenese, 3) MDSC's bijdragen aan het handhaven van ontsteking door hun vermogen om ROS te produceren en op hun beurt oxidatieve stress op cellulair niveau, 4) JAK-remmende therapie (momenteel het meest effectieve symptomatische medicijn voor het verminderen van splenomegalie en het opheffen van systemische symptomen bij PMF) zijn gunstige effect uitoefent niet alleen door down-regulatie van de JAK/STAT-route in hematopoëtische cellen van patiënten, maar ook door het remmen van ROS-productie in MDSC's.

De betekenis van het project ligt:

i) in de erkenning van een nieuw pathogenetisch mechanisme dat, samen met en aanvullend op DNA-mutatie, bijdraagt aan de verklaring van de fenotypische diversiteit die wordt waargenomen tijdens het klinische beloop van PMF; ii) in de identificatie van een nieuw doelwit voor gepersonaliseerde behandeling van PMF.

Het primaire doel van dit project is om de rol van MDSC's in het aanwakkeren van chronische ontsteking te onderzoeken (door analyse van cytokinen/chemokinen samen met hun receptoren), hun percentage te evalueren in correlatie met klinische/biologische parameters, modificaties na behandeling met JAK-remmers (JAK-i) te bestuderen, en hun deelname aan het neoangiogenetische proces te testen.

Primaire eindpunten:

• het fenotypisch en functioneel karakteriseren van MDSC-subsets (polymorfonucleaire (PMN)- en monocytische (M)-MDSC's) in het PB en BM van PMF-patiënten en gezonde proefpersonen. In geval van splenectomie zullen we de aanwezigheid van PMN-MDSC's en M-MDSC's evalueren in splen-afgeleide mononucleaire cellen vers verkregen van patiënten (die de procedure ondergaan om therapeutische redenen) en controles (na splenectomie voor traumatische letsels).
• de gegevens te correleren met klinische en biologische parameters evenals met het genotype van driver-mutaties van JAK2-, MPL- en CALR-genen bij PMF-patiënten.
• in plasmasamples van PMF en controles, cytokinen te beoordelen die betrokken zijn bij het ontstekingsproces, de immunosuppressieve functie, de angiogene activiteit en de verhoogde productie van MDSC's.

Secundaire eindpunten zijn:

1. onderzoeken of patiënt-afgeleide MDSC's, gekweekt onder proangiogene omstandigheden, in staat zijn te differentiëren in endotheelcellen onder angiogene kweekomstandigheden (flowcytometrie) en/of hun genexpressieprofiel te wijzigen (door RealTime -kwantitatieve PCR (RT-qPCR) voor-, na incubatie);
2. ex vivo de hypothese testen dat MDSC's betrokken zijn bij de neoangiogenetische processen die PMF kenmerken, door de aanwezigheid van endotheel-achtige MDSC's in PMF-weefsels te evalueren, immunofluorescentiekleuring uit te voeren in milt- en BM-secties en deze te analyseren met confocale microscopie;
3. verifiëren of MDSC's effectieve doelwitten zijn van JAK-remmende medicijnen, door in vitro de effecten van JAK1/JAK2-remmers op MDSC-activiteit en -functie te testen met flowcytometrie, RT-qPCR, ELISA-tests.