Myeloid-peräisten immunosupressorisolujen rooli primaarisessa myelofibroosissa

Primäärinen myelofibroosi (PMF) on Philadelphia-negatiivinen krooninen myeloproliferatiivinen häiriö, jolle on ominaista: pahanlaatuisen hematopoieettisen kantasolun CD34+ kloonilaajeneminen, luuydinfibroosi, splenomegalia, ekstramedullaarinen hematopoieesi sekä laaja uusangiogeneesi luuytimessä ja pernassa. 95 % potilaista on hankkinut JAK2-, CALR- tai MPL-geenien mutaation, joka aiheuttaa JAK-STAT-signaalireitin aktivoitumisen myeloideissä soluissa. Tulehdusta pidetään tällä hetkellä merkittävänä tekijänä PMF:n patogeneesissä, kuten korkeat ennusteellisesti merkittävät tulehdussytokiinitasot ja krooninen oksidatiivinen stressi kohonneilla reaktiivisilla happimolekyyleillä (ROS) osoittavat.

Myeloidiperäiset tukahduttajasolut (MDSC) ovat epäkypsiä myeloidejä soluja, jotka kertyvät syöpä-, sepsis- tai kroonista tulehdusta sairastavilla potilailla. Normaalitilassa MDSC:t siirtyvät luuytimestä eri ääreiselimistön elimiin, joissa ne erilaistuvat makrofageiksi, dendriittisoluiksi tai granulosyytteiksi. Kasvainympäristössä tuotetut sytokiinit ja kemokiinit houkuttelevat epäkypsiä myeloidejä soluja ääreisverenkiertoon (PB), pernaan, maksaan ja imusolmukkeisiin, estävät niiden erilaistumisen (STAT3-signaalireitin aktivoinnin kautta) ja aiheuttavat niiden aktivoitumisen MDSC:iksi. Tämä solupopulaatio jaetaan perinteisesti kahteen alaryhmään: polymorfonukleaarisiin (PMN)- ja monosyyttisiin (M)-MDSC:ihin. Lisäksi MDSC:illä on vahva kyky vähentää T/NK-solujen sytotoksisia toimintoja sekä potentiaali erilaistua endoteliaalisoluiksi ja liittyä kasvainendoteliaan, edistäen kasvainuusangiogeneesiä. Lopuksi Wang et al. havaitsivat korkeita kiertävien MDSC:iden pitoisuuksia myeloproliferatiivisia neoplasioita sairastavilla potilailla, jotka kykenivät estämään T-solujen lisääntymisen.

Nämä lähtökohdat viittaavat siihen, että MDSC:illä saattaisi olla rooli PMF:n patogeneesissä estämällä immuunisolujen toimintoja, ylläpitämällä sairaudelle ominaislaista kroonista tulehdusta ja/tai edistämällä angiogeneesiprosessia.

Krooninen tulehdustila liittyy yleensä MDSC:iden lisääntymiseen (määrä ja aktiivisuus), mikä edesauttaa tulehduksen ylläpitämistä ja voimistumista aiheuttamalla oksidatiivista stressiä ROS:n tuotannon kautta. PMF-potilailla tulehdusta pidetään merkittävänä tekijänä sairauden patogeneesissä, kuten korkeat ennusteellisesti merkittävät tulehdussytokiinitasot ja krooninen oksidatiivinen stressi osoittavat. Muutama vuosi sitten Wang et al. raportoivat hyvin rajoitetussa määrässä PMF-potilaita kiertävien MDSC:iden taajuuden lisääntymisestä; he eivät kuitenkaan kyenneet, luultavasti näytteiden pienen koon vuoksi, löytämään yhteyttä MDSC:iden määrän ja geneettisen taustan sekä sairauden fenotyypin välillä.

Tämän projektin perustelut juontuvat havainnoista, että PMF:ssä esiintyvät kaikki edellytykset MDSC:iden roolille sairauden patogeneesissä: a) krooninen tulehdustila, b) vaihteleva immuunijärjestelmän toimintahäiriön aste (joka yhdessä ajuri mutaatioiden aiheuttaman JAK/STAT-signaalireitin aktivoitumisen kanssa saattaa olla vastuussa sairauden etenemisestä), ja c) laajat uusangiogeneettiset prosessit.

Näiden näkökohtien perusteella tutkijat olettavat, että: 1) MDSC:iden määrän ja/tai toiminnan lisääntyminen liittyy PMF-potilailla kuvattuun immunologiseen toimintahäiriöön, 2) MDSC:t, kiitos kyvystään saavuttaa endoteliaalinen fenotyyppi ja toiminta, edesauttavat pernan ja luuytimen uusangiogeneesiä, 3) MDSC:t edesauttavat tulehduksen ylläpitämistä kyvyllään tuottaa ROS:ia ja siten solutasolla oksidatiivista stressiä, 4) JAK-estolääkitys (tällä hetkellä tehokkain oireita lievittävä lääke pernan koon pienentämiseen ja PMF:n systemaattisten oireiden poistamiseen) ei vaikuta hyödyllisesti vain alentamalla potilaiden hematopoieettisten solujen JAK/STAT-signaalireittiä, vaan myös estämällä ROS:n tuotantoa MDSC:issä.

Projektin merkitys piilee:

i) uuden patogeneettisen mekanismin tunnistamisessa, joka yhdessä DNA-mutaation kanssa ja sen lisäksi auttaa selittämään PMF:n kliinisessä kulussa havaittua fenotyyppistä monimuotoisuutta; ii) uuden kohteen löytämisessä PMF:n personoidulle hoidolle.

Tämän projektin ensisijainen tavoite on tutkia MDSC:iden roolia kroonisen tulehduksen ylläpidossa (analysoimalla sytokiinejä/kemokiinejä ja niiden reseptoreita), arvioida niiden prosenttiosuutta suhteessa kliinisiin/biologisiin parametreihin, tutkia muutoksia JAK-estolääkityksen (JAK-i) jälkeen, sekä testata niiden osallistumista uusangiogeneettiseen prosessiin.

Ensisijaiset päätepisteet:

• karakterisoida fenotyypillisesti ja funktionaalisesti MDSC-alaryhmiä (polymorfonukleaariset (PMN)- ja monosyyttiset (M)-MDSC:t) PMF-potilaiden ja terveiden henkilöiden ääreisverenkierrossa (PB) ja luuytimessä (BM). Splenektomian tapauksessa arvioimme PMN-MDSC:iden ja M-MDSC:iden esiintymistä vasta saaduissa pernasta peräisin olevissa monosyyttisissä soluissa potilailta (jotka ovat toimenpiteen kohteena terapeuttisista syistä) ja kontrollihenkilöiltä (jotka ovat splenektomian kohteena traumavammojen vuoksi).
• korreloida tiedot kliinisten ja biologisten parametrien sekä JAK2-, MPL- ja CALR-geenien ajuri mutaatioiden genotyypin kanssa PMF-potilailla.
• arvioida PMF-potilaiden ja kontrollihenkilöiden plasmanäytteistä tulehdusprosessiin, immunosuppressiiviseen toimintaan, angiogeneettiseen aktiivisuuteen ja MDSC:iden lisääntyneeseen tuotantoon liittyviä sytokiinejä.

Toissijaiset päätepisteet ovat:

1. tutkia, pystyvätkö potilailta peräisin olevat MDSC:t, viljeltynä proangiogeneettisissa olosuhteissa, erilaistumaan angiogeneettisissa endoteliaalisoluissa viljelyolosuhteissa (virtaussytometria) ja/tai muuttamaan geeniekspressioprofiiliaan (RealTime -kvantitatiivisella PCR:llä (RT-qPCR) ennen ja jälkeen inkuboinnin);
2. testata ex vivo hypoteesia, että MDSC:t osallistuvat PMF:lle ominaisiin uusangiogeneettisiin prosesseihin, arvioimalla endoteliaalisten kaltaisten MDSC:iden esiintymistä PMF-kudoksissa, suorittamalla immunofluoresenssivärjäyksiä pernan ja luuytimen leikkeissä ja analysoimalla niitä konfokaalimikroskopialla;
3. varmistaa, ovatko MDSC:t tehokkaita JAK-estolääkkeiden kohteita, testaamalla in vitro JAK1/JAK2-estäjien vaikutuksia MDSC:iden aktiivisuuteen ja toimintaan virtaussytometrialla, RT-qPCR:llä, ELISA-testeillä.