Rola komórek supresorowych pochodzenia szpikowego w pierwotnej mielofibrozie

Pierwotne włóknienie szpiku (PMF) to filadelfia-ujemna przewlekła mieloproliferacyjna choroba charakteryzująca się: klonalną ekspansją złośliwej komórki macierzystej hematopoezy CD34+, włóknieniem szpiku kostnego (BM), powiększeniem śledziony, pozaszpikową hematopoezą oraz rozległą neoangiogenezą w BM i śledzionie. 95% pacjentów ma nabyty mutację genów JAK2, CALR lub MPL determinującą aktywację szlaku JAK-STAT w linii mieloidalnej. Obecnie uważa się, że stan zapalny odgrywa istotną rolę w patogenezie PMF, co potwierdzają wysokie poziomy cytokin zapalnych o znaczeniu prognostycznym oraz stan przewlekłego stresu oksydacyjnego z podwyższonymi reaktywnymi formami tlenu (ROS).

Komórki supresorowe pochodzenia mieloidalnego (MDSC) to niedojrzałe komórki mieloidalne, które gromadzą się u pacjentów z nowotworami, sepsą lub przewlekłym stanem zapalnym. W stanie równowagi MDSC migrują z BM do różnych narządów obwodowych, gdzie różnicują się w makrofagi, komórki dendrytyczne lub granulocyty. Cytokiny i chemokiny wytwarzane w mikrośrodowisku guza rekrutują niedojrzałe komórki mieloidalne do krwi obwodowej (PB), śledziony, wątroby i narządów limfatycznych, zapobiegają ich różnicowaniu (poprzez aktywację szlaku sygnałowego STAT3) i indukują ich aktywację w MDSC. Ta populacja komórek jest konwencjonalnie podzielona na dwa podzbiory: polimorfojądrowe (PMN)- i monocytowe (M)-MDSC. Ponadto, MDSC mają silną zdolność do redukcji funkcji cytotoksycznych komórek T/NK oraz potencjał do różnicowania się w komórki śródbłonka i włączania się w śródbłonek guza, sprzyjając neoangiogenezie nowotworowej. Wreszcie, Wang i in. odkryli wysokie poziomy krążących MDSC u pacjentów z nowotworami mieloproliferacyjnymi, które były w stanie hamować proliferację komórek T.

Te przesłanki sugerują, że MDSC mogą odgrywać rolę w patogenezie PMF poprzez hamowanie niektórych funkcji komórek odpornościowych, podtrzymywanie przewlekłego stanu zapalnego charakteryzującego chorobę i/lub wzmacnianie procesu angiogenezy.

Stan przewlekłego stanu zapalnego jest powszechnie związany ze wzrostem MDSC (liczby i aktywności), co przyczynia się do utrzymywania i podsycania stanu zapalnego poprzez indukcję stresu oksydacyjnego za pomocą produkcji ROS. U pacjentów z PMF uważa się, że stan zapalny odgrywa istotną rolę w patogenezie choroby, co potwierdzają wysokie poziomy cytokin zapalnych o znaczeniu prognostycznym oraz stan przewlekłego stresu oksydacyjnego. Kilka lat temu Wang i in. zgłosili u bardzo ograniczonej liczby pacjentów z PMF wzrost częstości występowania krążących MDSC; jednakże, prawdopodobnie z powodu małej wielkości próbek, nie byli w stanie znaleźć żadnej korelacji między liczbą MDSC a zarówno podłożem genetycznym, jak i fenotypem choroby.

Racjonalność tego projektu wynika z obserwacji, że w PMF istnieją wszystkie przesłanki sprzyjające roli MDSC w patogenezie choroby: a) stan przewlekłego stanu zapalnego, b) różny stopień dysfunkcji układu odpornościowego (który, wraz z aktywacją szlaku JAK/STAT z powodu mutacji kierowczych, mógłby być odpowiedzialny za progresję choroby), oraz c) rozległe procesy neoangiogenne.

W oparciu o te rozważania, badacze postawili hipotezę, że: 1) wzrost liczby i/lub funkcji MDSC jest zaangażowany w dysfunkcję immunologiczną opisaną u pacjentów z PMF, 2) MDSC, dzięki swojej zdolności do nabywania fenotypu i funkcji śródbłonka, przyczyniają się do śledzionowej i szpikowej neoangiogenezy, 3) MDSC przyczyniają się do utrzymania stanu zapalnego poprzez swoją zdolność do produkcji ROS, a tym samym stresu oksydacyjnego na poziomie komórkowym, 4) terapia inhibitorami JAK (obecnie najskuteczniejszy lek objawowy do redukcji powiększenia śledziony i znoszenia objawów ogólnoustrojowych w PMF) wywiera swój korzystny efekt nie tylko poprzez down-regulację szlaku JAK/STAT w komórkach hematopoetycznych pacjentów, ale także poprzez hamowanie produkcji ROS w MDSC.

Znaczenie projektu polega:

i) w rozpoznaniu nowego mechanizmu patogenetycznego, który wraz z mutacją DNA i dodatkowo do niej przyczynia się do wyjaśnienia różnorodności fenotypowej obserwowanej podczas przebiegu klinicznego PMF; ii) w identyfikacji nowego celu dla spersonalizowanego leczenia PMF.

Głównym celem tego projektu jest zbadanie roli MDSC w podsycaniu przewlekłego stanu zapalnego (poprzez analizę cytokin/chemokin wraz z ich receptorami), ocena ich odsetka w korelacji z parametrami klinicznymi/biologicznymi, badanie modyfikacji po leczeniu inhibitorami JAK (JAK-i), przetestowanie ich udziału w procesie neoangiogenezy.

Punkty końcowe pierwotne:

• scharakteryzowanie, fenotypowo i funkcjonalnie, podzbiorów MDSC (polimorfojądrowe (PMN)- i monocytowe (M)-MDSC) we krwi obwodowej (PB) i szpiku kostnym (BM) pacjentów z PMF i zdrowych osób. W przypadku splenektomii ocenimy obecność PMN-MDSC i M-MDSC w świeżo pozyskanych komórkach jednojądrzastych pochodzących ze śledziony od pacjentów (poddających się zabiegowi z powodów terapeutycznych) i kontroli (po splenektomii z powodu urazów).
• skorelowanie danych z parametrami klinicznymi i biologicznymi oraz z genotypem mutacji kierowczych genów JAK2, MPL i CALR u pacjentów z PMF.
• ocena, w próbkach osocza od pacjentów z PMF i kontroli, cytokin zaangażowanych w proces zapalny, w funkcję immunosupresyjną, w aktywność angiogenną i w zwiększoną produkcję MDSC.

Punkty końcowe wtórne to:

1. zbadanie, czy MDSC pochodzące od pacjentów, hodowane w warunkach proangiogennych, są zdolne do różnicowania się w komórki śródbłonka w warunkach hodowli angiogennej (cytometria przepływowa) i/lub do modyfikacji profilu ekspresji genów (przez RealTime -ilościową PCR (RT-qPCR) przed-, po- inkubacji);
2. przetestowanie ex vivo hipotezy, że MDSC są zaangażowane w procesy neoangiogenne charakteryzujące PMF, oceniając obecność MDSC podobnych do śródbłonka w tkankach PMF, wykonując barwienia immunofluorescencyjne w skrawkach śledziony i BM i analizując je za pomocą mikroskopii konfokalnej;
3. sprawdzenie, czy MDSC są skutecznymi celami leków inhibitorów JAK, testując in vitro efekty inhibitorów JAK1/JAK2 na aktywność i funkcję MDSC za pomocą cytometrii przepływowej, RT-qPCR, testów ELISA.