Rollen af myeloid-afledte suppressor-celler i primær myelofibrose

Primær myelofibrose (PMF) er en Philadelphia-negativ kronisk myeloproliferativ lidelse, der er karakteriseret ved: klonal ekspansion af en malign hematopoietisk stamcelle CD34+, knoglemarvsfibrose, splenomegali, ekstramedullær hematopoiese og en omfattende neoangiogenese i knoglemarv og milt. Femoghalvfems % af patienterne har en erhvervet mutation i JAK2-, CALR- eller MPL-gener, der bestemmer en aktivering af JAK-STAT-vejen i den myeloide linje. Inflammation menes i øjeblikket at spille en relevant rolle i PMF-patogenese, som bevist af høje niveauer af inflammatoriske cytokiner med prognostisk signifikans og af en tilstand af kronisk oxidativ stress med forhøjede reaktive oxygenarter (ROS).

Myeloide afledte suppressor-celler (MDSC'er) er umodne myeloide celler, der akkumuleres hos patienter med maligniteter, sepsis eller kronisk inflammation. I steady state migrerer MDSC'er fra knoglemarven til forskellige perifere organer, hvor de differentierer til makrofager, dendritiske celler eller granulocytter. Cytokiner og kemokiner, der produceres i tumor-mikromiljøet, rekrutterer umodne myeloide celler i perifert blod (PB), milt, lever og lymfoide organer, forhindrer deres differentiering (gennem aktivering af STAT3-signalvejen) og inducerer deres aktivering til MDSC'er. Denne cellepopulation er konventionelt opdelt i to undergrupper: polymorfonukleære (PMN)- og monocytære (M)-MDSC'er. Derudover har MDSC'er den stærke evne til at reducere cytotoksiske funktioner af T-/NK-celler og potentialet til at differentiere til endothelceller og inkorporeres i tumorendothel, hvilket favoriserer tumorneoangiogenese. Endelig fandt Wang et al. høje niveauer af cirkulerende MDSC'er hos patienter med myeloproliferative neoplasmer, der var i stand til at hæmme T-celleproliferation.

Disse forudsætninger antyder, at MDSC'er kunne have en rolle i patogenesen af PMF ved at hæmme nogle funktioner af immunceller, nære den kroniske inflammation, der karakteriserer sygdommen, og/eller forstærke angiogenese-processen.

En tilstand af kronisk inflammation er almindeligvis forbundet med en stigning i MDSC'er (antal og aktivitet), der bidrager til at opretholde og brændstof inflammation gennem induktion af oxidativ stress ved hjælp af ROS-produktion. Hos PMF-patienter menes inflammation at spille en relevant rolle i sygdommens patogenese, som bevist af høje niveauer af inflammatoriske cytokiner med prognostisk signifikans og af en tilstand af kronisk oxidativ stress. For få år siden rapporterede Wang et al. i et meget begrænset antal patienter med PMF en stigning i hyppigheden af cirkulerende MDSC'er; de var dog ikke i stand, sandsynligvis på grund af den lille stikprøvestørrelse, til at finde nogen sammenhæng mellem antallet af MDSC'er og både den genetiske baggrund og sygdomsfænotypen.

Rationalet for dette projekt stammer fra observationerne, at i PMF eksisterer alle de forudsætninger, der favoriserer en rolle for MDSC'er i sygdommens patogenese: a) en status af kronisk inflammation, b) en varierende grad af dysfunktion i immunsystemet (der sammen med aktivering af JAK/STAT-vejen på grund af drivermutationer kunne være ansvarlig for sygdomsprogression), og c) omfattende neoangiogene processer.

Baseret på disse overvejelser hypoteser forskerne, at: 1) en stigning i antal og/eller funktion af MDSC'er er involveret i den immunologiske dysfunktion, der er beskrevet hos PMF-patienter, 2) MDSC'er, takket være deres evne til at erhverve en endothel-fænotype og -funktion, bidrager til splenisk og marv neoangiogenese, 3) MDSC'er bidrager til opretholdelsen af inflammation gennem deres kapacitet til at producere ROS og dermed oxidativ stress på cellulært niveau, 4) JAK-hæmmende terapi (i øjeblikket det mest effektive symptomatiske lægemiddel til at reducere splenomegali og afskaffe systemiske symptomer i PMF) udøver sin gavnlige effekt ikke kun ved at nedregulere JAK/STAT-vejen i hematopoietiske celler hos patienter, men også ved at hæmme ROS-produktion i MDSC'er.

Projektets betydning ligger:

i) i anerkendelsen af en ny patogenetisk mekanisme, der sammen med og ud over DNA-mutation bidrager til forklaringen af den fænotypiske diversitet, der observeres under PMF's kliniske forløb; ii) i identifikationen af et nyt mål for personlig behandling af PMF.

Det primære mål med dette projekt er at undersøge MDSC'ers rolle i at brændstof kronisk inflammation (gennem analysen af cytokiner/kemokiner sammen med deres receptorer), at evaluere deres procentdel i sammenhæng med kliniske/biologiske parametre, at studere ændringer efter behandling med JAK-hæmmere (JAK-i), at teste deres deltagelse i den neoangiogene proces.

Primære endepunkter:

• at karakterisere, fænotypisk og funktionelt, MDSC-understammer (polymorfonukleære (PMN)- og monocytære (M)-MDSC'er) i PB og knoglemarv hos PMF-patienter og raske personer. I tilfælde af splenektomi vil vi evaluere tilstedeværelsen af PMN-MDSC'er og M-MDSC'er i miltafledte mononukleære celler, friskt opnået fra patienter (der gennemgår proceduren af terapeutiske årsager) og kontroller (efter splenektomi for traumatiske læsioner).
• at korrelere dataene med kliniske og biologiske parametre såvel som med genotypen af drivermutationer i JAK2-, MPL- og CALR-gener hos PMF-patienter.
• at vurdere, i plasmaprøver fra PMF og kontroller, cytokiner involveret i inflammationsprocessen, i den immunsuppressive funktion, i den angiogene aktivitet og i den øgede produktion af MDSC'er.

Sekundære endepunkter er:

1. undersøge om patientafledte MDSC'er, dyrket i proangiogene forhold, er i stand til at differentiere til endothelceller i angiogene dyrkningsforhold (flowcytometri) og/eller at ændre deres genudtryksprofil (ved RealTime -kvantitativ PCR (RT-qPCR) før-, efter- inkubation);
2. teste ex vivo hypotesen om, at MDSC'er er involveret i de neoangiogene processer, der karakteriserer PMF, ved at evaluere tilstedeværelsen af endothel-lignende MDSC'er i PMF-væv, udføre immunofluorescensfarvning i milt- og knoglemarvssektioner og analysere dem ved konfokal mikroskopi;
3. verificere om MDSC'er er effektive mål for JAK-hæmmer-lægemidler, ved at teste in vitro effekterne af JAK1/JAK2-hæmmere på MDSC-aktivitet og -funktion ved flowcytometri, RT-qPCR, ELISA-tests.