Roll av myeloida suppressorceller vid primär myelofibros

Primär myelofibros (PMF) är en Philadelphia-negativ kronisk myeloproliferativ störning som kännetecknas av: klonal expansion av en malign hematopoietisk stamcell CD34+, benmärgsfibros, splenomegali, extramedullär hematopoies och en omfattande neoangiogenes i benmärg och mjälte. Nittiofem % av patienterna har en förvärvad mutation i JAK2-, CALR- eller MPL-generna som leder till en aktivering av JAK-STAT-signalvägen i den myeloida linjen. Inflammation anses för närvarande spela en relevant roll i PMF-patogenesen, vilket bevisas av höga nivåer av inflammatoriska cytokiner med prognostisk betydelse och av ett tillstånd av kronisk oxidativ stress med förhöjda reaktiva syreföreningar (ROS).

Myeloida härledda suppressorceller (MDSCs) är omogna myeloida celler som ansamlas hos patienter med maligniteter, sepsis eller kronisk inflammation. I stadiet av jämvikt migrerar MDSCs från benmärgen till olika perifera organ, där de differentierar till makrofager, dendritiska celler eller granulocyter. Cytokiner och kemokiner som produceras i tumörmikromiljön rekryterar omogna myeloida celler i perifert blod (PB), mjälte, lever och lymfoida organ, förhindrar deras differentiering (genom aktivering av STAT3-signalvägen) och inducerar deras aktivering till MDSCs. Denna cellpopulation är konventionellt indelad i två undergrupper: polymorfonukleära (PMN)- och monocytiska (M)-MDSCs. Dessutom har MDSCs en stark förmåga att minska cytotoxiska funktioner hos T-/NK-celler och potentialen att differentiera till endotelceller och inkorporeras i tumörendoteliet, vilket gynnar tumörneoangiogenes. Slutligen fann Wang et al. höga nivåer av cirkulerande MDSCs hos patienter med myeloproliferativa neoplasi som kunde inhibera T-cellproliferation.

Dessa premisser tyder på att MDSCs skulle kunna ha en roll i patogenesen av PMF genom att inhibera vissa funktioner hos immunceller, nära den kroniska inflammation som kännetecknar sjukdomen och/eller stimulera angiogenesprocessen.

Ett tillstånd av kronisk inflammation är vanligtvis associerat med en ökning av MDSCs (antal och aktivitet) som bidrar till att upprätthålla och underhålla inflammation genom induktion av oxidativ stress via ROS-produktion. Hos PMF-patienter anses inflammation spela en relevant roll i sjukdomens patogenes, vilket bevisas av höga nivåer av inflammatoriska cytokiner med prognostisk betydelse och av ett tillstånd av kronisk oxidativ stress. För några år sedan rapporterade Wang et al. i ett mycket begränsat antal patienter med PMF en ökning av frekvensen av cirkulerande MDSCs; de kunde dock inte, troligen på grund av den lilla storleken på proverna, hitta något samband mellan antalet MDSCs och både den genetiska bakgrunden och sjukdomens fenotyp.

Rationalet för detta projekt härrör från observationerna att i PMF existerar alla premisser som gynnar en roll för MDSCs i sjukdomens patogenes: a) ett tillstånd av kronisk inflammation, b) en varierande grad av dysfunktion i immunsystemet (som, tillsammans med aktivering av JAK/STAT-vägen på grund av drivermutationer, skulle kunna vara ansvarig för sjukdomsprogression), och c) omfattande neoangiogena processer.

Baserat på dessa överväganden hypoteserar forskarna att: 1) en ökning i antal och/eller funktion av MDSCs är involverad i den immunologiska dysfunktion som har beskrivits hos PMF-patienter, 2) MDSCs, tack vare deras förmåga att förvärva en endotel fenotyp och funktion, bidrar till splenisk och märgneoangiogenes, 3) MDSCs bidrar till upprätthållandet av inflammation genom deras kapacitet att producera ROS och i sin tur oxidativ stress på cellnivå, 4) JAK-hämmarbehandling (för närvarande det mest effektiva symtomatiska läkemedlet för att minska splenomegali och avskaffa systemiska symptom i PMF) utövar sin fördelaktiga effekt inte bara genom att nedreglera JAK/STAT-vägen i hematopoietiska celler hos patienter, utan också genom att inhibera ROS-produktion i MDSCs.

Projektets betydelse ligger:

i) i erkännandet av en ny patogenetisk mekanism som, tillsammans med och utöver DNA-mutation, bidrar till förklaringen av den fenotypiska mångfalden som observeras under PMF:s kliniska förlopp; ii) i identifieringen av ett nytt mål för personifierad behandling av PMF.

Det primära målet med detta projekt är att undersöka MDSCs roll i att underhålla kronisk inflammation (genom analys av cytokiner/kemokiner tillsammans med deras receptorer), att utvärdera deras procentandel i korrelation med kliniska/biologiska parametrar, att studera förändringar efter behandling med JAK-hämmare (JAK-i), att testa deras deltagande i neoangiogenesprocessen.

Primära slutpunkter:

• att karakterisera, fenotypiskt och funktionellt, MDSC-underuppsättningar (polymorfonukleära (PMN)- och monocytiska (M)-MDSCs) i PB och BM hos PMF-patienter och friska försökspersoner. I fall av splenektomi kommer vi att utvärdera närvaron av PMN-MDSCs och M-MDSCs i mjältehärledda mononukleära celler färskt erhållna från patienter (som genomgår ingreppet av terapeutiska skäl) och kontroller (efter splenektomi för traumatiska skador).
• att korrelera data med kliniska och biologiska parametrar såväl som med genotypen för drivermutationer i JAK2-, MPL- och CALR-generna hos PMF-patienter.
• att bedöma, i plasmaprover från PMF och kontroller, cytokiner involverade i inflammationsprocessen, i den immunosuppressiva funktionen, i den angiogena aktiviteten och i den ökade produktionen av MDSCs.

Sekundära slutpunkter är:

1. undersöka om patienthärledda MDSCs, odlade i proangiogena förhållanden, är kapabla att differentiera till endotelceller angiogena odlingsförhållanden (flödescytometri) och/eller att modifiera deras genuttrycksprofil (genom RealTime-kvantitativ PCR (RT-qPCR) före-, efter- inkubering);
2. testa ex vivo hypotesen att MDSCs är involverade i de neoangiogena processer som kännetecknar PMF, genom att utvärdera närvaron av endotelliknande MDSCs i PMF-vävnader, utföra immunofluorescensfärgning i mjälte- och BM-sektioner och analysera dem med konfokal mikroskopi;
3. verifiera om MDSCs är effektiva mål för JAK-hämmarläkemedel, genom att testa in vitro effekterna av JAK1/JAK2-hämmare på MDSC-aktivitet och funktion med flödescytometri, RT-qPCR, ELISA-tester.