Role of Myeloid-derived Suppressor Cells In Primary Myelofibrosis

Primární myelofibróza (PMF) je Philadelphia-negativní chronická myeloproliferativní porucha charakterizovaná: klonální expanzí maligní hematopoetické kmenové buňky CD34+, fibrózou kostní dřeně (KD), splenomegalií, extramedulární hematopoézou a rozsámou neoangiogenezí v KD a slezině. U 95 % pacientů se vyskytuje získaná mutace genů JAK2, CALR nebo MPL, která určuje aktivaci JAK-STAT dráhy v myeloidní linii. Předpokládá se, že zánět hraje významnou roli v patogenezi PMF, což dokazují vysoké hladiny zánětlivých cytokinů s prognostickým významem a stav chronického oxidačního stresu se zvýšenými reaktivními formami kyslíku (ROS).

Myeloidní supresorové buňky (MDSC) jsou nezralé myeloidní buňky, které se hromadí u pacientů s malignitami, sepsí nebo chronickým zánětem. Za normálních podmínek migrují MDSC z KD do různých periferních orgánů, kde se diferencují na makrofágy, dendritické buňky nebo granulocyty. Cytokiny a chemokiny produkované v mikroprostředí nádoru rekrutují nezralé myeloidní buňky v periferní krvi (PK), slezině, játrech a lymfoidních orgánech, zabraňují jejich diferenciaci (prostřednictvím aktivace signální dráhy STAT3) a indukují jejich aktivaci na MDSC. Tato buněčná populace se konvenčně dělí na dvě podskupiny: polymorfonukleární (PMN)- a monocytární (M)-MDSC. Kromě toho mají MDSC silnou schopnost snižovat cytotoxické funkce T/NK buněk a potenciál diferencovat se na endotelové buňky a začlenit se do nádorového endotelu, což podporuje nádorovou neoangiogenezi. Nakonec Wang et al. zjistili vysoké hladiny cirkulujících MDSC u pacientů s myeloproliferativními neoplaziemi, které byly schopné inhibovat proliferaci T buněk.

Tato východiska naznačují, že MDSC by mohly hrát roli v patogenezi PMF tím, že inhibují některé funkce imunitních buněk, podporují chronický zánět charakteristický pro toto onemocnění a/nebo posilují proces angiogeneze.

Stav chronického zánětu je běžně spojen se zvýšením MDSC (počtu a aktivity), což přispívá k udržování a podněcování zánětu prostřednictvím indukce oxidačního stresu produkci ROS. U pacientů s PMF se předpokládá, že zánět hraje významnou roli v patogenezi onemocnění, což dokazují vysoké hladiny zánětlivých cytokinů s prognostickým významem a stav chronického oxidačního stresu. Před několika lety Wang et al. popsali u velmi omezeného počtu pacientů s PMF zvýšení frekvence cirkulujících MDSC; však pravděpodobně kvůli malé velikosti vzorků nebyli schopni najít žádnou korelaci mezi počtem MDSC a jak genetickým pozadím, tak fenotypem onemocnění.

Opodstatnění tohoto projektu vychází z pozorování, že u PMF existují všechna východiska, která podporují roli MDSC v patogenezi onemocnění: a) stav chronického zánětu, b) různý stupeň dysfunkce imunitního systému (který spolu s aktivací JAK/STAT dráhy způsobenou driver mutacemi by mohl být zodpovědný za progresi onemocnění), a c) rozsáhlé neoangiogenní procesy.

Na základě těchto úvah výzkumníci předpokládají, že: 1) zvýšení počtu a/nebo funkce MDSC se podílí na imunologické dysfunkci, která byla popsána u pacientů s PMF, 2) MDSC díky své schopnosti získat endotelový fenotyp a funkci přispívají k splenické a dřeňové neoangiogenezi, 3) MDSC přispívají k udržování zánětu prostřednictvím své schopnosti produkovat ROS a následně oxidační stres na buněčné úrovni, 4) terapie JAK inhibitory (v současnosti nejúčinnější symptomatický lék ke snížení splenomegalie a odstranění systémových příznaků u PMF) vyvíjí svůj příznivý účinek nejen tím, že down-reguluje JAK/STAT dráhu v hematopoetických buňkách pacientů, ale také inhibicí produkce ROS v MDSC.

Význam projektu spočívá:

i) v rozpoznání nového patogenetického mechanismu, který spolu s a navíc k DNA mutaci přispívá k vysvětlení fenotypové rozmanitosti pozorované během klinického průběhu PMF; ii) v identifikaci nového cíle pro personalizovanou léčbu PMF.

Primárním cílem tohoto projektu je prozkoumat roli MDSC při podněcování chronického zánětu (prostřednictvím analýzy cytokinů/chemokinů spolu s jejich receptory), vyhodnotit jejich procento v korelaci s klinickými/ biologickými parametry, studovat změny po léčbě JAK inhibitory (JAK-i), otestovat jejich účast na neoangiogenním procesu.

Primární cíle:

• charakterizovat fenotypicky a funkčně podskupiny MDSC (polymorfonukleární (PMN)- a monocytární (M)-MDSC) v PK a KD pacientů s PMF a zdravých subjektů. V případě splenektomie vyhodnotíme přítomnost PMN-MDSC a M-MDSC v mononukleárních buňkách odvozených ze sleziny čerstvě získaných od pacientů (podstupujících výkon z terapeutických důvodů) a kontrol (po splenektomii pro traumatická poranění).
• korelovat data s klinickými a biologickými parametry a s genotypem driver mutací genů JAK2, MPL a CALR u pacientů s PMF.
• vyhodnotit v plazmatických vzorcích od PMF a kontrol cytokiny zapojené do zánětlivého procesu, do imunosupresivní funkce, do angiogenní aktivity a do zvýšené produkce MDSC.

Sekundární cíle jsou:

1. zkoumat, zda MDSC odvozené od pacientů, kultivované v proangiogenních podmínkách, jsou schopné diferencovat v endotelové buňky angiogenních kultivačních podmínek (průtoková cytometrie) a/nebo modifikovat svůj genový expresní profil (pomocí RealTime -kvantitativní PCR (RT-qPCR) před-, po- inkubaci);
2. testovat ex vivo hypotézu, že MDSC jsou zapojeny do neoangiogenních procesů charakteristických pro PMF, vyhodnocením přítomnosti endotelům podobných MDSC v tkáních PMF, provedením imunofluorescenčního barvení v řezech sleziny a KD a jejich analýzou pomocí konfokální mikroskopie;
3. ověřit, zda jsou MDSC efektivními cíli léků JAK inhibitorů, testováním in vitro účinků inhibitorů JAK1/JAK2 na aktivitu a funkci MDSC pomocí průtokové cytometrie, RT-qPCR, ELISA testů.