Papel das Células Supressoras de Origem Mieloide na Mielofibrose Primária

A mielofibrose primária (PMF) é uma doença mieloproliferativa crónica Filadélfia-negativa caracterizada por: expansão clonal de uma célula estaminal hematopoiética maligna CD34+, fibrose da medula óssea (MO), esplenomegalia, hematopoiese extramedular e uma extensa neoangiogénese na MO e no baço. Noventa e cinco % dos doentes têm uma mutação adquirida dos genes JAK2, CALR ou MPL que determina uma ativação da via JAK-STAT na linhagem mieloide. Atualmente, pensa-se que a inflamação desempenha um papel relevante na patogénese da PMF, como comprovado pelos elevados níveis de citocinas inflamatórias com significado prognóstico e por um estado de stress oxidativo crónico com elevadas espécies reativas de oxigénio (ERO).

As células supressoras de origem mieloide (MDSCs) são células mieloides imaturas que se acumulam em doentes com malignidades, sépsis ou inflamação crónica. Em estado estável, as MDSCs migram da MO para diferentes órgãos periféricos, onde se diferenciam em macrófagos, células dendríticas ou granulócitos. As citocinas e quimiocinas produzidas no microambiente tumoral recrutam células mieloides imaturas no sangue periférico (SP), baço, fígado e órgãos linfoides, impedem a sua diferenciação (através da ativação da via de sinalização STAT3) e induzem a sua ativação em MDSCs. Esta população celular é convencionalmente dividida em dois subconjuntos: MDSCs polimorfonucleares (PMN) e MDSCs monocíticas (M). Além disso, as MDSCs têm uma forte capacidade de reduzir as funções citotóxicas das células T/NK e o potencial de se diferenciarem em células endoteliais e se incorporarem no endotélio tumoral, favorecendo a neoangiogénese tumoral. Finalmente, Wang et al. encontraram elevados níveis de MDSCs circulantes em doentes com neoplasias mieloproliferativas que eram capazes de inibir a proliferação de células T.

Estas premissas sugerem que as MDSCs poderiam ter um papel na patogénese da PMF, inibindo algumas funções das células imunitárias, alimentando a inflamação crónica que caracteriza a doença e/ou impulsionando o processo de angiogénese.

Uma condição de inflamação crónica está comumente associada a um aumento das MDSCs (número e atividade) que contribui para manter e alimentar a inflamação através da indução de stress oxidativo por meio da produção de ERO. Nos doentes com PMF, pensa-se que a inflamação desempenha um papel relevante na patogénese da doença, como comprovado pelos elevados níveis de citocinas inflamatórias com significado prognóstico e por um estado de stress oxidativo crónico. Há alguns anos, Wang et al. relataram, num número muito limitado de doentes com PMF, um aumento da frequência de MDSCs circulantes; no entanto, não conseguiram, provavelmente devido ao pequeno tamanho das amostras, encontrar qualquer correlação entre o número de MDSCs e tanto o background genético como o fenótipo da doença.

A fundamentação deste projeto deriva das observações de que na PMF existem todas as premissas que favorecem um papel das MDSCs na patogénese da doença: a) um estado de inflamação crónica, b) um grau variável de disfunção do sistema imunitário (que, juntamente com a ativação da via JAK/STAT devido a mutações condutoras, poderia ser responsável pela progressão da doença), e c) extensos processos neoangiogénicos.

Com base nestas considerações, os investigadores formulam a hipótese de que: 1) um aumento no número e/ou função das MDSCs está envolvido na disfunção imunológica que tem sido descrita em doentes com PMF, 2) as MDSCs, graças à sua capacidade de adquirir um fenótipo e função endoteliais, contribuem para a neoangiogénese esplénica e medular, 3) as MDSCs contribuem para a manutenção da inflamação através da sua capacidade de produzir ERO e, por sua vez, stress oxidativo a nível celular, 4) a terapia com inibidores de JAK (atualmente o fármaco sintomático mais eficaz para reduzir a esplenomegalia e abolir os sintomas sistémicos na PMF) exerce o seu efeito benéfico não só por down-regulação da via JAK/STAT nas células hematopoiéticas dos doentes, mas também por inibir a produção de ERO nas MDSCs.

A significância do projeto reside:

i) no reconhecimento de um novo mecanismo patogénico que, em conjunto e para além da mutação do DNA, contribui para explicar a diversidade fenotípica observada durante o curso clínico da PMF; ii) na identificação de um novo alvo para o tratamento personalizado da PMF.

O objetivo principal deste projeto é investigar o papel das MDSCs no agravamento da inflamação crónica (através da análise de citocinas/quimiocinas juntamente com os seus recetores), avaliar a sua percentagem em correlação com parâmetros clínicos/biológicos, estudar modificações após tratamento com inibidores de JAK (JAK-i), testar a sua participação no processo neoangiogénico.

Endpoints primários:

• caracterizar, fenotipicamente e funcionalmente, os subconjuntos de MDSCs (MDSCs polimorfonucleares (PMN) e MDSCs monocíticas (M)) no SP e MO de doentes com PMF e indivíduos saudáveis. No caso de esplenectomia, avaliaremos a presença de PMN-MDSCs e M-MDSCs em células mononucleares derivadas do baço obtidas recentemente de doentes (submetidos ao procedimento por razões terapêuticas) e controlos (após esplenectomia por lesões traumáticas).
• correlacionar os dados com parâmetros clínicos e biológicos, bem como com o genótipo das mutações condutoras dos genes JAK2, MPL e CALR em doentes com PMF.
• avaliar, em amostras de plasma de PMF e controlos, as citocinas envolvidas no processo inflamatório, na função imunossupressora, na atividade angiogénica e no aumento da produção de MDSCs.

Os endpoints secundários são:

1. investigar se as MDSCs derivadas de doentes, cultivadas em condições proangiogénicas, são capazes de se diferenciar em células endoteliais em condições de cultura angiogénica (citometria de fluxo) e/ou de modificar o seu perfil de expressão genética (por PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR) antes e após incubação);
2. testar ex vivo a hipótese de que as MDSCs estão envolvidas nos processos neoangiogénicos que caracterizam a PMF, avaliando a presença de MDSCs semelhantes a endoteliais em tecidos de PMF, realizando coloração por imunofluorescência em cortes de baço e MO e analisando-os por microscopia confocal;
3. verificar se as MDSCs são alvos eficazes de fármacos inibidores de JAK, testando in vitro os efeitos dos inibidores de JAK1/JAK2 na atividade e função das MDSCs por citometria de fluxo, RT-qPCR, testes de ELISA.