Ruolo delle Cellule Soppressorie di Origine Mieloide nella Mielofibrosi Primaria

La mielofibrosi primaria (PMF) è una neoplasia mieloproliferativa cronica Philadelphia-negativa caratterizzata da: espansione clonale di una cellula staminale ematopoietica maligna CD34+, fibrosi midollare, splenomegalia, ematopoiesi extramidollare e un'estesa neoangiogenesi nel midollo osseo e nella milza. Il 95% dei pazienti presenta una mutazione acquisita dei geni JAK2, CALR o MPL che determina un'attivazione della via di segnalazione JAK-STAT nel lignaggio mieloide. Attualmente si ritiene che l'infiammazione svolga un ruolo rilevante nella patogenesi della PMF, come dimostrato dagli alti livelli di citochine infiammatorie con significato prognostico e da uno stato di stress ossidativo cronico con elevati livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS).

Le cellule soppressorie di derivazione mieloide (MDSC) sono cellule mieloidi immature che si accumulano in pazienti con neoplasie, sepsi o infiammazione cronica. In condizioni fisiologiche, le MDSC migrano dal midollo osseo a diversi organi periferici, dove si differenziano in macrofagi, cellule dendritiche o granulociti. Le citochine e le chemochine prodotte nel microambiente tumorale reclutano cellule mieloidi immature nel sangue periferico (PB), nella milza, nel fegato e negli organi linfoidi, ne impediscono la differenziazione (attraverso l'attivazione della via di segnalazione STAT3) e ne inducono l'attivazione in MDSC. Questa popolazione cellulare viene convenzionalmente suddivisa in due sottogruppi: MDSC polimorfonucleate (PMN) e MDSC monocitiche (M). Inoltre, le MDSC possiedono una forte capacità di ridurre le funzioni citotossiche delle cellule T/NK e il potenziale di differenziarsi in cellule endoteliali e di incorporarsi nell'endotelio tumorale, favorendo la neoangiogenesi tumorale. Infine, Wang et al. hanno riscontrato alti livelli di MDSC circolanti in pazienti con neoplasie mieloproliferative, in grado di inibire la proliferazione delle cellule T.

Queste premesse suggeriscono che le MDSC potrebbero avere un ruolo nella patogenesi della PMF inibendo alcune funzioni delle cellule immunitarie, alimentando l'infiammazione cronica che caratterizza la malattia e/o potenziando il processo di angiogenesi.

Una condizione di infiammazione cronica è comunemente associata a un aumento delle MDSC (numero e attività) che contribuisce a mantenere e alimentare l'infiammazione attraverso l'induzione dello stress ossidativo mediante la produzione di ROS. Nei pazienti con PMF, si ritiene che l'infiammazione svolga un ruolo rilevante nella patogenesi della malattia, come dimostrato dagli alti livelli di citochine infiammatorie con significato prognostico e da uno stato di stress ossidativo cronico. Alcuni anni fa, Wang et al. hanno riportato, in un numero molto limitato di pazienti con PMF, un aumento della frequenza delle MDSC circolanti; tuttavia, non sono stati in grado, probabilmente a causa della piccola dimensione dei campioni, di trovare alcuna correlazione tra il numero di MDSC e sia il background genetico che il fenotipo della malattia.

La logica di questo progetto deriva dalle osservazioni che nella PMF esistono tutte le premesse che favoriscono un ruolo delle MDSC nella patogenesi della malattia: a) uno stato di infiammazione cronica, b) un grado variabile di disfunzione del sistema immunitario (che, insieme all'attivazione della via JAK/STAT dovuta a mutazioni driver, potrebbe essere responsabile della progressione della malattia), e c) estesi processi neoangiogenici.

Sulla base di queste considerazioni, gli investigatori ipotizzano che: 1) un aumento del numero e/o della funzione delle MDSC sia coinvolto nella disfunzione immunologica descritta nei pazienti con PMF, 2) le MDSC, grazie alla loro capacità di acquisire un fenotipo e una funzione endoteliale, contribuiscano alla neoangiogenesi splenica e midollare, 3) le MDSC contribuiscano al mantenimento dell'infiammazione attraverso la loro capacità di produrre ROS e, a sua volta, stress ossidativo a livello cellulare, 4) la terapia con inibitori di JAK (attualmente il farmaco sintomatico più efficace per ridurre la splenomegalia e abolire i sintomi sistemici nella PMF) eserciti il suo effetto benefico non solo regolando negativamente la via JAK/STAT nelle cellule ematopoietiche dei pazienti, ma anche inibendo la produzione di ROS nelle MDSC.

Il significato del progetto risiede:

i) nel riconoscimento di un nuovo meccanismo patogenetico che, insieme e in aggiunta alla mutazione del DNA, contribuisce a spiegare la diversità fenotipica osservata durante il decorso clinico della PMF; ii) nell'identificazione di un nuovo bersaglio per il trattamento personalizzato della PMF.

L'obiettivo primario di questo progetto è indagare il ruolo delle MDSC nell'alimentare l'infiammazione cronica (attraverso l'analisi di citochine/chemochine insieme ai loro recettori), valutarne la percentuale in correlazione con parametri clinici/biologici, studiare le modificazioni dopo trattamento con inibitori di JAK (JAK-i), testare la loro partecipazione al processo neoangiogenico.

Endpoint primari:

• caratterizzare, fenotipicamente e funzionalmente, i sottogruppi di MDSC (MDSC polimorfonucleate (PMN) e MDSC monocitiche (M)) nel sangue periferico e nel midollo osseo di pazienti con PMF e soggetti sani. In caso di splenectomia, valuteremo la presenza di PMN-MDSC e M-MDSC in cellule mononucleate derivate dalla milza fresca ottenute da pazienti (sottoposti alla procedura per motivi terapeutici) e controlli (a seguito di splenectomia per lesioni traumatiche).
• correlare i dati con parametri clinici e biologici nonché con il genotipo delle mutazioni driver dei geni JAK2, MPL e CALR nei pazienti con PMF.
• valutare, in campioni di plasma di pazienti con PMF e controlli, le citochine coinvolte nel processo infiammatorio, nella funzione immunosoppressiva, nell'attività angiogenica e nell'aumentata produzione di MDSC.

Gli endpoint secondari sono:

1. indagare se le MDSC derivate da pazienti, coltivate in condizioni proangiogeniche, siano in grado di differenziarsi in cellule endoteliali in condizioni di coltura angiogenica (citometria a flusso) e/o di modificare il loro profilo di espressione genica (mediante PCR quantitativa in tempo reale (RT-qPCR) prima e dopo l'incubazione);
2. testare ex vivo l'ipotesi che le MDSC siano coinvolte nei processi neoangiogenici che caratterizzano la PMF, valutando la presenza di MDSC endotelio-simili nei tessuti di PMF, eseguendo colorazioni di immunofluorescenza in sezioni di milza e midollo osseo e analizzandole mediante microscopia confocale;
3. verificare se le MDSC siano bersagli efficaci dei farmaci inibitori di JAK, testando in vitro gli effetti degli inibitori di JAK1/JAK2 sull'attività e sulla funzione delle MDSC mediante citometria a flusso, RT-qPCR, test ELISA.