Kulturní média a vývoj blastocyst

SOUHRN:

V postupech ART lze přenos blastocyst považovat za nejvíce fyziologickou situaci, protože embryo je umístěno v děložní dutině ve stadiu nejvíce podobném tomu, které se vyskytuje v přírodě. Tyto potenciální přínosy přiměly stále více center k přechodu ze stadia štěpení do stadia blastocystového přenosu embryí po celém světě (Maheshwari et al., 2016). Navzdory tomu existují také některé potenciální nevýhody. Tento přístup snižuje celkový počet použitelných embryí (definovaných jako embrya dostupná pro transfer nebo kryokonzervaci) (Glujovsky et al., 2016). Byly rovněž vzneseny určité obavy týkající se bezpečnosti tohoto přístupu. Zejména prodloužená doba kultivace in vitro může mít dlouhodobý účinek na vývoj embrya. V nedávné metaanalýze byl přenos stadia blastocysty ve skutečnosti spojen se zvýšeným rizikem předčasného porodu (< 37 týdnů), velmi předčasného porodu (< 32 týdnů), vysokého gestačního věku a perinatální úmrtnosti, ačkoli posledně jmenovaná byla identifikována pouze z jedna studie. Naopak přenos blastocyst byl spojen se snížením rizika malých pro gestační věk a mizejících dvojčat, ačkoli toto bylo hlášeno pouze jednou studií (Martins et al., 2017).

Kulturní média hrají v tomto kontextu klíčovou roli. Byly navrženy dva odlišné přístupy zaměřené na podporu vývoje embrya do stadia blastocysty: sekvenční přístup „zpět k přírodě“ a přístup „nechat embryo vybrat“ jediné médium (Summers et al., 2003; Machtinger et al., 2012, Quinn 2012).

Systém sekvenčního kultivačního média je navržen tak, aby vyhovoval identifikovaným měnícím se metabolickým a nutričním požadavkům vyvíjejícího se embrya ode dne 1 do dne 5 (Gardner et al. 1996, 1997, 1998, 1999). S tímto přístupem jsou embrya pěstována až do 3. dne v prvním médiu a poté, ve fázi štěpení, jsou přesunuta do druhého média. Cílem je vystavit embrya médiím specifickým pro stadium, navrženým tak, aby odrážely pozorované změny koncentrací pyruvátu, laktátu a glukózy ve vejcovodu oproti děloze (Gardner et al., 1996).

Na druhé straně je cílem jediného kultivačního média umožnit vyvíjejícím se embryím vybrat si živiny, které potřebují, a zároveň minimalizovat stres z vystavení náhlé změně jejich kultivačního prostředí v den 3. Jedno médium lze použít s výměnou média v den 3 nebo v jednokrokové nepřerušované kultuře, ve které není žádné médium osvěžující 3. den [Biggers et al., 2008]. Dostupné údaje porovnávající výkonnost jednotlivých kultivačních médií vs. sekvenční naznačují, že oba typy médií zřejmě poskytují podobnou podporu vyvíjejícímu se embryu (Sfontouris et al., 2017).

Cíl studie a návrh

Cílem této neintervenční studie je porovnat rychlost blastulace na oplodněný oocyt ve dvou různých komerčně dostupných jednokrokových kultivačních médiích (GEMS a Irvine kultivační média).

Odběr oocytů

Bude proveden postupný odběr vajíček (včetně oocytů pocházejících od ženy ne starší 42 let, která má 4 až 8 normálně vypadajících oocytů MII a podstupující léčbu ICSI s ejakulovaným spermatem v Centru reprodukční medicíny GENERA v Římě). Pro vyloučení potenciálního negativního otcovského vlivu na rychlost blastulace budou vyloučeny všechny oocyty pocházející z párů s chirurgicky extrahovanými spermiemi a velmi závažnou oligoastenoteratozoospermií (počet pohyblivých spermií < 500 000/ml po přípravě). Oocyty pocházející od pacientek zařazených do programu PGD pro monogenní onemocnění nebo strukturální chromozomální abnormality budou rovněž vyloučeny.

Odhaduje se, že na základě zkušeností centra bude studie trvat 18 měsíců. Informovaný souhlas je standardní formát GENERA v běžném používání. Studie bude schválena Institucionální revizní radou kliniky.

Denudace, hodnocení a injekce oocytů Všechny postupy budou prováděny podle standardní praxe bez jakéhokoli zásahu.

Těsně po odběru budou oocyty obnaženy z cumulus oophorus krátkou expozicí 40 IU/ml roztoku hyaluronidázy s následným mechanickým odstraněním corona radiata pomocí plastových pipet definovaných průměrů v prostředí s řízenou teplotou. Tento postup bude proveden mezi 37 a 40 hodinami po podání hCG. Oocyty metafáze II (MII) budou poté odděleny od nezralých oocytů a vyhodnoceny na stereomikroskopu. Ti s těžkými morfologickými abnormalitami budou považováni za méně kvalitní (podle Rienzi et al., 2008) a budou tak vyloučeni ze srovnání. Všechny MII oocyty budou umístěny do stejné Petriho misky.

Pomocí randomizačních tabulek budou oocyty od každé pacientky náhodně rozděleny do dvou skupin, které budou nezávisle inseminovány a následně uchovávány ve 2 jednokrokových kultivačních médiích, GEMS (GERI Medium) a Irvine (Continuous Single Culture Complete with HSA). Oocyty budou podrobeny ICSI za použití dříve popsaných technik a přístrojů (Rienzi et al., 1998). Aby bylo možné sledovat vývojovou progresi jednotlivých oocytů, budou inseminované oocyty z každé skupiny kultivovány v samostatných miskách a každý jednotlivý oocyt bude identifikován podle své polohy v mikrojamkách misky. Kultivace embryí bude trvat do 5. dne a bude prováděna v časosběrném inkubátoru (GERI, Genea) v hypoxické atmosféře obsahující 6 % CO2 a 5 % O2.

Hodnocení embryí

Podle postupu GENERA bude pomocí morfokinetické analýzy hodnocena podrobná analýza různých událostí během vývoje embrya (syngamie, štěpení, zhutnění a blastulace). Budou hodnoceny různé parametry: doba mezi koncem procedury ICSI a syngamií, dokončení štěpení na 2, 3, 4, 5 a 8 buněk (T2, T3, T4, T5, T8, v tomto pořadí); délka prvního, druhého a třetího buněčného cyklu (CC1, CC2 a CC3 v tomto pořadí) a synchronizace v dělení od tří do čtyř a pěti až osmi buněk (S2 a S3, v tomto pořadí). Standardní morfologické hodnocení blastocyst bude provedeno podle kritérií uvedených Gardnerem a Schoolcraftem (1999). Stručně řečeno, blastocysty budou hodnoceny podle stupně expanze, kvality vnitřní buněčné hmoty (ICM) a buněk trofektodermu (TE). ICM se hodnotí podle počtu buněk a stupně zhutnění, zatímco TE se hodnotí podle počtu, rozměru buněk a vzhledu epitelu (kohezivní nebo volný). Zaznamenány budou také morfokinetické parametry související s tvorbou blastocyst, a to zejména: zahájení zhutňování, zahájení blastulace a dokončení blastulace (TSC, TSB, resp. TB).

Statistická hlediska Primárním koncovým bodem studie je rychlost blastulace, vypočítaná jako procento oplodněných vajíček kultivovaných v obou médiích, která se vyvinou do stadia blastocysty v každé polovině kohorty. Vzhledem k tomu, že způsobilé budou pouze ženy se 4 až 8 získanými oocyty a oocyty od každé ženy budou náhodně rozděleny do 2 skupin, za předpokladu 80% míry oplodnění bude studovaná populace, která má být analyzována, složena z X*2 (kde X je počet zapsaných žen) skupiny 2+ oocytů, polovina kultivovaná v jednom médiu a druhá kultivovaná ve druhém médiu. Nejzřejmějším přístupem k analýze výsledných dat je uvažovat je jako soubor X (= počet žen) 2x2 tabulek, kde veličinou, která má být odhadnuta, je poměr šancí blastulace jednoho média vůči druhému. být analyzován pomocí Mantel Haenszelova postupu, přičemž stratifikačním faktorem je žena (primární analýza). Za předpokladu celkové míry výbuchu 34 % odpovídá minimální relevantní rozdíl 7 % poměru pravděpodobnosti výbuchu 1,4. Aby bylo možné detekovat s alfa = 5 % (2-sided) a výkonem = 80 % poměr pravděpodobnosti 1,4, je třeba zahrnout přibližně 1200 (1182) oocytů (Hulley et al., 2013) rozdělených do 2 stejně velkých skupin. , což odpovídá přibližně 160 - 200 ženám (cca. Odebráno 6 oocytů/žena s ohledem na míru oplodnění 80 %).

V sekundární průzkumné analýze bude k datům přizpůsoben logistický model s blastulací jako závislou binární proměnnou a ženou jako stratum, aby se vyhodnotila prediktivní hodnota různých prognostických faktorů a možné interakce mezi každým z nich a kultivačním médiem.